2.1 Получение векторных конструкций.
Клонирование рекомбинантных генов и их экспрессия с образованием белковых продуктов клетками E. сoli позволяет осуществить производство многих полезных эукариотических белков, которые другим способом получить очень трудно.
В ходе экспериментальной работы были собраны две векторные конструкции для прямой и гибридной экспрессии. В качестве основы была взята коммерческая плазмида pGEMEX1 (Novagen, США).
Рисунок _. – Плазмиды pTNGF и pTSumoNGF. На рисунке обозначены: NGF – ген, отвечающий за синтез фактора роста нервов, SumoNGF - ген, отвечающий за синтез гибридного белка, Ori (Origin) - регион автономной репликации и регион, f1 Ori,??? , bla (AmpR) - ген придающий устойчивость к ампицилину, Т7pr – промотор, обеспечивающий инициацию трансткипции, Т7ter – терминатор - последовательность нуклеотидов, узнаваемая РНК-полимеразой, как сигнал к прекращению синтеза РНК.
2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
На первом этапе с помощью научной литературы была изучена последовательность олигонуклеотидов гена фактора роста нервов, который расположен на коротком плече, первой хромосомы человека []. Далее была произведена модификация данной последовательности путем добавления на 5/ конец сайта рестрикции NdeI а на 3/ конец XhoI (Приложение _ ).
Н
а
основе данной последовательности были
подобраны 12 праймеров для последовательной
сборки гена (Приложение _ ). Сборку гена
NGF
осуществляли в несколько этапов c
помощью метода ПЦР-амплификации (Рисунок
_ ).
Рисунок _. – Сборка гена NGF методом ПЦР.
В результате был собран ген человеческого фактора роста нервов, который в дальнейшем был использован для создания экспрессионных конструкций (Рисунок _ ).
Рисунок _ . – Ген NGF c модифицированными концами.
2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
Для прямой экспрессии в используемую плазмиду по сайтам NdeI и XhoI был проклонирован ранее полученный ген, кодирующий человеческий фактор роста нервов (NGF), под транскрипционный контроль Т7 промотора. Основные этапы работы по получению pTNGF изображенны на рисунке _.
Полученную с помощью ПЦР- амплификации последовательность гена фактора роста нервов расщепляли эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. Расщепление плазмиды pGEMEX1 проходило в два этапа. Сначала рестрикции проводили по сайтам NdeI и AatII, а затем XhoI и AatII. В результате получили два вектора длиной 2092 п.о (Вектор 1) и 1049 п.о (Вектор 2) соответственно. Контроль расщепления ДНК рестриктазами осуществлялся с помощью электрофоретического разделения ДНК в агарозном геле.
Рисунок _. - Основные этапы сборки векторной конструкции pTNGF.
После выделения из геля фрагмента, проводили трехкомпонентное лигирование (фрагмент NGF, вектор 1 и вектор 2). В результате получили лигазную смесь, которой трансформировали компетентные клетки штамма XL1-Blue. Затем трансформированные клетки высевали на агаризованную питательную среду YT с ампициллином, в качестве селективного агента.
Бактериальные клоны анализировали на содержание нужного фрагмента быстрым ПЦР-скринингом, используя праймеры T7 и Sp6 на начало промотора и конец терминатора. (Рисунок _ ).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
400 п.н
Рисунок _ - ПЦР – скрининг бактериальных клонов.
1-10 – плазмидная ДНК бактериальных клонов № 1 – 10, 11 – положительный контроль, фрагмент NGF.
Из результатов скрининга видно, что у всех отобранных клонов наработался фрагмент соответствующий положительному контролю. В качестве положительного контроля был взят ген NGF. Полученные результаты свидетельствуют о наличии целевой вставки в составе вектора. Но данного исследования недостаточно, чтобы дать окончательный ответ о правильности сборки конструкции.
Отобранные для дальнейшего исследования колонии № 5 – 10 инокулировали в 3 мл YT среды и выращивали в течении ночи при 37оС в стерильных пробирках на 15 мл. С 3 мл. ночной культуры была собрана биомасса и выделена плазмидная ДНК при помощи набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Полученные векторные конструкции секвенировали в Межинститутском Центре коллективного пользования “ГЕНОМ” Центр “Биоинженерия” РАН. Правильность последовательности ДНК гена SumoNGF и сопутствующих областей в плазмиде была подтверждена секвенированием (Приложение _ )
Правильность последовательности ДНК гена NGF и сопутствующих областей в плазмиде была подтверждена секвенированием (Приложение _ )