- •Реферат
- •Введение
- •Обзор и анализ научно технической и патентной информации.
- •Нейтрофины.
- •Общая характеристика.
- •1.2 Нейротрофины в цнс
- •2. Рецепторы нейтрофинов.
- •2.1Высокоаффинный рецептор к нейротрофинам pl40 prototrk
- •2.2 Низкоаффинный рецептор к нейротрофинам p75lntr.
- •Фактор роста нервов.
- •История открытия
- •3.2 Молекулярная характеристика.
- •Третичная структура.
- •3.4 Механизм взаимодействия ngf с рецепторами.
- •3.5 Захват и ретроградный транспорт ngf.
- •3.6 Функции ngf в организме.
- •3.6.1 Действие ngf на нервные клетки.
- •3.6.2 Значение ngf в метаболизме.
- •3.6.3 Участие ngf в патологических состояниях.
- •4. Современные достижения в получении рекомбинантного ngf для фармацевтической индустрии.
- •5 Экспрессия рекомбинантных генов.
- •5.1 Вводная часть.
- •5.2 Конструирование экспрессионных векторов и их функционирование.
- •5.3 Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов.
- •6 Выводы по разделу
- •Основная часть
- •1. Материалы, методы и оборудование
- •1.1 Оборудование
- •1.2 Программное обеспечение
- •1.3 Лабораторные посуда и расходные материалы.
- •1.4 Штаммы e.Coli
- •1.5 Среды для выращивания бактерий
- •1.6 Препараты днк
- •1.7 Ферменты
- •1.7 Реактивы и наборы реактивов
- •Приготовление рвs буфера (х10):
- •10% Уксусная кислота
- •1.9.1 Рестрикция
- •1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
- •1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
- •1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1.9.5 Лигирование.
- •1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
- •1.9.7 Культивирование, выделение и очистка плазмидной днк из клеток e. Coli
- •1.9.8 Проведение пцр-скрининга.
- •1.9.9 Секвенированиеплазмидной днк.
- •1.9.10 Быстрая трансформация.
- •1.9.11 Анализ экспрессии целевого гена.
- •1.9.12 Выделение суммарного (общего) белка из клеток e. Сoli.
- •1.9.14 Фракционирование белков из клеток e. Сoli.
- •1.9.15 Денатурирующий белковый электрофорез в sds-пааг.
- •1.9.16 Отмывка телец включения
- •1.9.17 Растворение телец включения
- •1.9.18 Выделение SumoNgf при помощи металло-хелат-аффинной хроматографии
- •1.9.19 Рефолдинг белка
- •1.9.20 Расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2. Экспериментальные исследования
- •2.1 Получение векторных конструкций.
- •2.1.1 Сборка гена ngf методом пцр.
- •2.1.2 Получение векторной конструкции pTngf
- •2.1.3 Получение гибридной последовательности SumoNgf.
- •2.1.4 Получение векторной конструкции pTSumoNgf.
- •2.2 Биосинтез целевого и гибридного белка. Подбор условий культивирования.
- •2.2.1 Биосинтез белка ngf.
- •2.2.1 Биосинтез гибридного белка SumoNgf.
- •2.3 Выделение и очистка рекомбинантного фактора роста нервов человека.
- •2.3.1 Отмывка и растворение телец включения
- •2.3.2 Металло-хелатная аффинная хроматография
- •2.3.3 Масс-спектрометрия гибридного белка ngf
- •2.3.4 Рефолдинг гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Ферментативное расщепление гибридного белка SumoNgf
- •2.3.5 Очистка ngf на катионобменной хроматографии.
- •2.3.5 Разработка обобщённой схемы производства рекомбинантного ngf
- •Организационно – экономический раздел
- •Технико-экономическое обоснование нир
- •2. Расчёт затрат на научно-исследовательскую работу
- •2.1. Расчет материальных затрат (Cм)
- •2.2. Энергетические затраты.
- •4.2.3. Расчет затрат на заработную плату.
- •2.4. Расчет затрат на стеклянную посуду, стеклянные приборы и пластик.
- •4.2.5. Амортизационные отчисления (Сам.).
- •2.6. Накладные расходы.
- •3 Выводы по разделу
- •Безопасность жизнедеятельности
- •1 Краткая характеристика выполняемой работы.
- •2 Опасные и вредные производственные факторы на основных стадиях выполнения дипломной работы.
- •3 Перечень наиболее опасных мест на стадиях выполнения дипломной работы.
- •Основные физико-химические, токсические и пожаровзрывоопасные свойства используемых в работе веществ.
- •5 Обеспечение безопасности труда в лаборатории.
- •6 Производственная санитария.
- •6.1 Установление категории лабораторного помещения.
- •6.2 Разработка мероприятий по работе с вредными веществами.
- •6.3 Метеорологические условия.
- •6.4 Вентиляция.
- •6.5 Освещение.
- •6.7 Отопление.
- •7 Техника безопасности.
- •7.1 Электробезопасность.
- •7.2 Пожарная профилактика.
- •8. Выводы по разделу.
10% Уксусная кислота
Окрашивающий раствор:
10% уксусная кислота, 0,006% Coomassie G-250 Brilliant Blue.
Буфера для очистки гибридного белка методом МХАХ на HisTrap HP:
Буфера для очистки 20-кД ГР методом анионообменной хроматографии:
1.9 Методы исследований
1.9.1 Рестрикция
Рестрикцию проводили из расчета 20 ед. фермента на 1 мкг плазмидной ДНК. Общий объем реакционной смеси определялся количеством расщепляемой ДНК и концентрацией используемых ферментов. Буферы для эндонуклеаз рестрикции подбирались согласно рекомендациям производителей. Рестрикционную смесь (плазмидная ДНК, ферменты, буферы для ферментов, вода) инкубировали в течение 2 часов при 370 С.
1.9.2 Электрофоретичское разделение днк в агарозном геле.
Для разделения фрагментов ДНК или плазмидной ДНК использовали 1,5 – 2% агарозный гель, приготовленный на трис-боратном буфере (TBE) с 0.5 мкг/мл бромистого этидия. Электрофорез проводили в буфере TBE при напряженности электрического поля 6 В/см. По окончании электрофореза гель просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе ATM (Bio Tech Med Aps, Дания).
1.9.3 Выделение днк из агарозного геля.
При ультрафиолетовом освещении из агарозного геля скальпелем вырезали полосу, соответствующую нужному фрагменту ДНК, и затем очищали от агарозы при помощи набора MiniSpin Elute Gel Extraction Kit (QIAGEN) согласно инструкциям изготовителя.
1.9.4. Полимеразная цепная реакция (пцр).
ПЦР при помощи KAPA2G ДНК полимеразы.
Реакционная смесь на 25 мкл.содержала 25 нг. матричной ДНК, 0.2 mMdNTP, по 0.50 микромоль олигонуклеотидных праймеров и 0.5 едениц термостабильной KAPA2G ДНК полимеразы в 5 мкл. 5X KAPA 2G BufferA. Проводили 20-30 циклов реакции амплификации по следующей схеме: плавление ДНК при 95оС в течение 15 секунд, отжиг1праймеров в течение 15 секунд, и элонгация цепи при 72оС в течение 30 секунд2. В конце проводили завершающую элонгацию в течение 3 минут. По завершении реакции наличие нужного продукта проверяли электрофорезом в агарозном геле.
ПЦР при помощи PfuI ДНК-полимеразы
Реакционная смесь содержала 50 нг матричной ДНК, по 2 пмоль олигонуклеотидных праймеров, по 2,5 мМ каждого из четырех dNTP и 1-2.5 ед. термостабильной Pfu ДНК-полимеразы в 50 мкл реакционного буфера: 20 мМTris-HCl (pH 8.8 при 25С), 10 мМ (NH4)2SO4, 10 мМKCl, 0.1% тритона X-100, 0.1 мг/мл БСА. Проводили 20-30 циклов реакции амплификации по следующей схеме: плавление ДНК при 96С в течение 30 секунд, отжиг праймеров в течение 30 секунд, и элонгация цепи при 74С в течение 1 минуты. В конце проводили завершающую элонгацию в течение 5 минут. По завершении реакции наличие нужного продукта проверяли электрофорезом в агарозном геле.
1.9.5 Лигирование.
Реакцию лигирования проводили, используя ДНК лигазу фага Т4, согласно рекомендациям фирмы-изготовителя фермента. В качестве контроля использовали реакционную смесь без фрагмента.
1.9.6 Pipes трансформация клеток e. Coli плазмидной днк
Компетентные клетки, хранившиеся при -70С, размораживали во льду 10 минут, затем добавляли холодный раствор ДНК (~10 нг в объеме 1-5 мкл) и инкубировали во льду в течение 30 минут, периодически встряхивая. Далее проводили «heat shock»: пробирку с клетками инкубировали 30 секунд на водяной бане при температуре 420 С и затем помещали на 5 минут в лёд. В стерильных условиях добавляли 900 мкл среды YT, инкубировали при 370 С в термостате с умеренным перемешиванием (250 об/мин) 1 час и рассевали на чашки с YT -агаром, содержащим ампициллин. Выращивание проводили в течение ночи при 37С.