1.5. Крысы oxys – модель преждевременного старения и

связанных с ним изменений мозга

Создание и характеристика биологических моделей социально значимых заболеваний человека – один из подходов к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения и профилактики. В последние годы лавинообразно нарастает количество генетических моделей, среди которых доминируют моногенные: это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход позволяет приблизиться к пониманию вклада конкретного гена в развитие признака, но не воспроизводит фенотипические проявления заболеваний полигенной природы. В полной мере это относится к «заболеваниям пожилого возраста», которые развиваются у людей зачастую параллельно и на фоне комплексных проявлений старения, критический возраст манифестации которых существенно различается. Создание моделей, воспроизводящих такую ситуацию – сложная задача, но именно такой подход представляется оптимальным для поиска и испытания новых способов терапии и профилактики. В мире существует практически одна признанная модель преждевременного старения: созданная японскими учеными линия мышей SAM (senescence accelerated mouse), которая представлена сегодня 12-ю сублиниями, различающимися по характеру расстройств в эмоциональной сфере, циркадианных ритмов, степени и природе нарушений когнитивных функций и других проявлений старения [Takeda Т. et al., 1998 ,2009] .

В последнее десятилетие получены убедительные доказательства того, что полноценной моделью преждевременного старения и связанных с ним изменений мозга может служить созданная в 70-е гг. в Институте цитологии и генетики СО РАН линия крыс OXYS. Первое сообщение о создании сублинии, полученной селекцией и инбридингом крыс Вистар, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы, появилось в 1975 г. [Соловьёва Н.А. и др., 1975]. В 5-ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой. Для этих крыс оказались характерными множественные патологические проявления: катаракты, эмфиземы, кардиомиопатии, предраковые состояния, нарушение памяти, а также низкие рождаемость и продолжительность жизни [Елисеева А.Г. и др., 1975]. Следует подчеркнуть, что эти признаки анализировались или на фоне нагрузки галактозой, или же в ближайших последующих поколениях. В дальнейшем отбор проводился по ранней спонтанной катаракте.

В 1977 г. крыс зарегистрировали как линию W/SSM - Вистар-Салганик-Соловьёва-Морозкова, с наследственной галактоземией, однако в последующие 10 лет интерес к ним постепенно снижался. Ситуация кардинально изменилась в первой половине 90-х годов, когда в тканях (в печени и миокарде) этих животных методом электронного парамагнитного резонанса было обнаружено повышенное образование радикалов кислорода в ответ на добавление перекиси водорода [Salganik R.I. et al., 1994]. В 1996 году животные были зарегистрированы Р.И. Салгаником как линия OXYS с ключевой характеристикой «врожденная гиперпродукция кислородных радикалов» [Rat genome database: http://rgd.mcw.edu.].

То, что свободные радикалы могут быть причиной изменений в клетках и тканях живых организмов, приводящих к их старению, доказано многочисленными исследованиями [Dowling D.K., Simmons L.W., 2009]. Согласно современным представлениям, ведущую роль в старении неделящихся клеток играют изменения в митохондриях, которые, в то же время, являются основным источником АФК. Показано, что функциональные нарушения митохондрий появляются уже у молодых крыс OXYS и нарастают с возрастом [Salganik R.I. et al., 1994; Шабалина И.Г. и др., 1995]. В возрасте 3 месяцев у них обнаружены изменения соотношения цитохромов внутренней мембраны митохондрий, снижение активности F₁F₀-ATФ-синтетазы, дыхательного контроля и скорости фосфорилирования. На морфологическом уровне были выявлены структурные изменения митохондрий: деструкция крист, лизис матрикса, снижение объёмной и поверхностной плотности митохондрий [Колосова Н.Г., Айдагулова С.В. и др., 2001; Бакарев М.А., Непомнящих Л.М., 2004]. Предполагалось, что структурно-функциональные изменения состояния митохондрий крыс OXYS, могут быть и причиной, и следствием усиленной генерации АФК, накопления окислительных повреждений макромолекул. Однако методами хемилюминесцентного анализа показано, что продукция АФК митохондриями печени у крыс OXYS не только не повышена, но даже ниже, чем у крыс Вистар [Меньщикова и др., 2002]. Проведенные в дальнейшем исследования выявили разнонаправленные возрастные изменения уровня окислительных повреждений в различных компартментах клеток печени животных обеих линий [Колосова Н.Г. et. al., 2004]. Характер изменений активности ферментов антиоксидантной защиты не позволил сделать вывод о том, что её снижение является причиной повышенной чувствительности крыс OXYS к окислительному стрессу.

Анализ состояния линии, выполненный в конце 90-х годов прошлого века, показал, что не все заявленные ранее патологические проявления у крыс OXYS так же отчетливо выражены. Так, встречаемость новообразований в молодом возрасте у них не превышала таковую у крыс исходной линии Вистар, не выявлялись эмфиземы, заболеваемость катарактой в возрасте 6 мес. не превышала 30%. Усиление отбора по признаку ранней спонтанной катаракты в 58-63 поколениях крыс OXYS привело к устойчивой стопроцентной заболеваемости в этом возрасте [Колосова Н.Г. и др., 2003]. Сцеплено с катарактой крысы OXYS унаследовали комплекс фенотипических проявлений преждевременного старения, который устойчиво проявляется в последующих поколениях (на сегодня это уже 94 поколение). Это, прежде всего, ускоренная инволюция тимуса [Markova E.V. et. al., 2003; Obukhova L.A. et. al., 2009], гипертрофическая кардиомиопатия миокарда [Непомнящих Л.М., Семёнов Д.Е. и др., 1994], ранний остеопороз [Muraleva N.A. et. al., 2010], артериальная гипертензия на фоне снижения продукции оксида азота - фактора релаксации сосудов [Bobko А.А. et al., 2005]. Максимальная продолжительность жизни крыс OXYS снижена на 28% по сравнению с крысами Вистар: 24,6±6 и 36,8±5 мес., соответственно, р<0,01 (данные на 2002 г.).

Оказалось, что инволюция тимуса у крыс OXYS, как и у крыс Вистар, начинается с двухмесячного возраста, однако происходит ускоренными темпами [Obukhova L.A., 2009], что, очевидно, и приводит к снижению активности Т-клеточного звена иммунной системы [Маркова Е.В. и др., 2003]. Связанные со старением организма иммунодефициты, аутоиммунные и онкологические заболевания тесно связаны с нарушением функциональной активности гемопоэтических стволовых клеток. У крыс OXYS выявлены характерные для стареющих людей и животных изменения гранулопоэза: увеличение количества ранних и эритроидных предшественников свидетельствующие о глубоких изменениях функционального состояния гемопоэтической стволовой клетки, которые начинаются в возрасте 3 месяцев и к году усиливаются [Орловская И.А. и др., 2007].

Раннее развитие катаракты – ключевой признак линии крыс OXYS, по которому контролируется её состояние. На сегодня в возрасте 6 мес. патологические изменения хрусталиков регистрируются у 100% животных. У крыс Вистар заболеваемость достигает 100% к возрасту 24 месяцев, но и в этом возрасте катаракта не всегда поражает оба глаза [Колосова Н.Г. и др., 2003]. По своему характеру катаракта у крыс OXYS соответствует сенильной катаракте человека, и в 98% случаев протекает на фоне дистрофических изменений сетчатки, аналогичных тем, что регистрируются у людей с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД) – заболеванием, которое на сегодня становится основной причиной слепоты и слабовидения у людей старше 60 лет в развитых странах. Достаточно часто оба этих заболевания развиваются одновременно и у людей, однако природа сочетанного их течения остается не ясной. Известно, что патогенез и катаракты, и ВМД связаны с окислительным стрессом [Totan Y. et. al., 2009; Rhone M., Basu A., 2008]. Однако в хрусталиках и сетчатке крыс OXYS с активно прогрессирующими патологическими изменениями не удалось выявить повышенного содержания маркеров окислительного стресса. Окислительный стресс хоть и является патогенетическим фактором развития катаракты, не лежит в основе её этиологии у крыс OXYS. Ранние стадии развития катаракты сопровождаются активацией антиоксидантной защиты хрусталика - повышением содержания восстановленного глутатиона, уровень которого снижается драматически при формировании выраженных патологических изменений [Rumyantseva Y.V., Fursova A.Zh., 2008]. В то же время уже на ранних стадиях заболевания у крыс OXYS снижена экспрессия генов α-кристаллинов - основных структурных белков хрусталика со свойствами шаперонов, которые обеспечивают его прозрачность [Rumyantseva Y.V., Fursova A.Zh., 2008]. Развитию катаракты у крыс OXYS могут способствовать нарушения метаболизма триптофана и его метаболитов кинуренинов, которые играют роль ультрафиолетовых фильтров в хрусталиках [Snytnikova О.А. et. al., 2009]. Установлена связь развития ретинопатии у крыс OXYS с нарушениями кровообращения в сосудистой оболочке глаза, которые провоцируют гипоксию сетчатки, структурно-функциональные нарушения её пигментного эпителия и становятся причиной усиленной гибели нейросенсорных клеток [Жданкина А.А. и др.,2008].

Остеопороз - типичный спутник старения - развивается у крыс OXYS уже к возрасту 6 месяцев. Его проявлениями становятся нарушение минерализации костной ткани [Колосова Н.Г., Куторгин Г.Д., Сафина А.Ф., 2002], снижение её минеральной плотности [Фаламеева О.В. и др., 2006]. Замедление роста и минерализации костной ткани происходит на фоне недостаточного накопления в ней минеральных компонентов (Сa и Sr), снижения уровня Са в сыворотке крови и его усиленной экскреции с мочой [Муралёва Н.А. и др., 2010]. Как и у людей, развитие остеопороза у крыс OXYS связано с нарушением процесса ремоделирования костной ткани: доминированием процессов резорбции над остеосинтезом, нарушением метаболизма протеогликанов [Ершов К.И. и др., 2009].

К моменту постановки задач настоящего исследования, несмотря на многочисленные упоминания о нарушениях высшей нервной деятельности, исследованию функций мозга крыс OXYS было посвящено только две работы. Это выполненная ещё на животных 4-5 поколений, т.е. на фоне приёма галактозы, работа А.Г. Елисеевой и соавторов [1975] и работа Л.В.Лоскутовой и Н.Г.Колосовой [2000]. В работе последней сообщалось о сниженных, по сравнению с крысами Вистар, способности к обучению условной реакции пассивного избегания и поисково-исследовательской активности, а также о повышенной тревожности трехмесячных крыс OXYS

Примечательно, что при оценке уровня окислительных повреждений белков и липидов в гомогенатах мозга трехмесячных крыс OXYS не были выявлены отличия от контрольных крыс Вистар. Но сниженный уровень восстановленного глутатиона и повышенная активность супероксиддисмутазы, фермента антиоксидантной защиты, синтез которого активируется АФК, в мозге молодых крыс OXYS указывали на напряжение систем антиоксидантной защиты. Как мы показали, их несостоятельность проявилась у крыс OXYS в условиях дополнительной нагрузки – при эмоциональном стрессе [Колосова Н.Г., Трофимова Н.А.и др., 2005].

Исследуя связь преждевременного старения крыс OXYS с окислительным стрессом, Н.Г.Колосовой и соавторами [2005] был проведен сравнительный анализ активности свободнорадикальных процессов в различных структурах мозга: среднем мозге, гиппокампе, гипоталамусе, миндалине, фронтальной коре, прилежащих ядрах и стриатуме - используя в качестве маркёра содержание ПОЛ. Оказалось, что межрегиональные различия существенны в мозге крыс обеих линий, но более выражены у крыс Вистар. У крыс OXYS содержание продуктов ПОЛ выше в 2 мес. - в среднем мозге, гиппокампе, прилежащих ядрах и стриатуме, в 18 мес. - в среднем мозге, гиппокампе и прилежащих ядрах. В 18 мес. продуктов ПОЛ больше, чем в 2 мес. в миндалине и прилежащих ядрах крыс Вистар и в прилежащих ядрах и среднем мозге OXYS, а в гиппокампе и гипоталамусе меньше у крыс обеих линий, в стриатуме - у OXYS. Из полученных результатов следует, что уровень продуктов ПОЛ у крыс OXYS повышен, по сравнению с контролем, в критических для обучения и памяти структурах мозга, что указывает на их связь с окислительным стрессом.

Таким образом, на момент постановки задач настоящей работы о некоторых особенностях поведения крыс OXYS было известно, однако оставалось не ясным, проявляются эти признаки у крыс OXYS с рождения, становятся проявлениями ускоренного старения мозга или развиваются в связи с нарушением зрительной функции. Неоднозначными представлялись и данные о связи преждевременного старения мозга крыс OXYS с окислительным стрессом, убедительным аргументом в пользу которого, может стать доказательство возможности влияния на его проявления с помощью антиоксидантов. И, наконец, убедительным подтверждением развития в мозге крыс OXYS характерных для старения нейродегенеративных процессов может явиться их визуализация методами магниторезонансной томографии.