- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
(НИТРАТРЕДУКТАЗА)
Используя соответствующий дикий штамм Е. coli (например, ML 30 или К-12) и нитрат-редуктазный тест, можно продемонстрировать индукцию нитратредуктазы. Для этого к среде добавляют NО3- и выращивают культуру в анаэробных условиях. Можно также измерить накопление и после дующую утилизацию NO2- в культуральной среде. Эти два процесса служат индикаторами регуляции активности нитрат-(или нитрит-) редуктазной системы.
Свежую культуру после одной ночи выращивания высевают в несколько колб с основной средой, содержащей (на 1 л): 2 г КН2РО4, 7 г К2НРО4, 1 г (NH4)2S04 и 0,1 г MgSO4·6H2O, pH 7,2. Непосредствен но перед инокуляцией добавляют в нее стерильный раствор, содержащий 0,02 М глюкозу и 0,25% (конечная концентрация) безвитаминного гидролизата казеина. Культуру выращивают при сильном встряхивании до по лучения приблизительно 50 мкг клеток (сухого веса) на 1 мл среды или дольше (до видимого помутнения среды) и затем обрабатывают следующим образом.
Культура А: добавляют 20 мМ NaNO3 и поддерживают в аэробных условиях.
Культура Б: добавляют 20 мМ NaNO3 и создают анаэробные условия, поместив культуру в плотно закрывающийся сосуд и пропуская через нее N2 или смесь N2—CO2 (95 и 5% соответственно).
Культура В: NaNO3 не добавляют, но создают анаэробные условия, как описано выше.
Культура Г: добавляют 20 мМ NaNO3) поддерживают в аэробных условиях в течение нескольких часов, затем создают анаэробные условия (как для культуры Б). Если необходимо, культуру вновь переводят в аэробные условия спустя несколько часов.
Подобный эксперимент можно разработать и осуществить при изучении регуляции деградирующей треониндегидратазы. Подобно нитратредуктазе, этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и репрессируется сАМР и катаболитами.
В обоих случаях отбирают пробы культуры (если мутность настолько высока, что мешает последующему анализу, пробы центрифугируют) и определяют образование NO2- по следующей методике. Пробы из каждой культуры (0,2 мл) добавляют к 1 мл реактива А, содержащего 0,80% сульфаниловой кислоты в 5 н. уксусной кислоте. Пробы разбавляют до 10 мл 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, затем добавляют 1,0 мл реактива Б (6 мл диметил-α-нафтиламина в 1 л 5 н. уксусной кислоты). Оставляют на 30 мин для развития окраски, измеряют оптическую плотность при 540 нм и вычисляют концентрацию NO2- в каждой пробе по ранее полученной калибровочной кривой.
Можно также отбирать пробы культур и после центрифугирования измерять активность нитратредуктазы в клетках. Этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и требует в качестве индуктора NO3- (удаление NO3- приводит к деиндукции).
2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
Этот важный регуляторный процесс легко демонстрируется на большинстве штаммов Е. coli при сравнении культур, выращенных на основной среде, содержа щей глюкозу и минеральные соли, в присутствии L-аргинина и без него [31]. Орнитин - карбамоилтрансфераза катализирует шестую, заключительную, стадию синтеза конечного продукта - L-аргинина. В присутствии L-apгинина синтез фермента репрессируется. Это можно показать при выращивании дикого штамма в течение ночи в любой подходящей солевой среде, содержащей для культуры 1: 0,02 М раствор глюкозы; для культуры 2: 0,02 М раствор глюкозы и L-аргинин (100 мкг/мл); для культуры 3: 0,02 М раствор глюкозы и другую аминокислоту, например гистидин (100 мкг/мл). Клетки собирают, промывают 0,1 М трис-НС1-буфером, рН 7,8, и определяют орнитин - карбамоилтрансферазу.
2.3 МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ РЕПРЕССИЯ (L-ТРЕОНИНДЕГИДРАТАЗА)
С помощью подобной же серии опытов можно продемонстрировать чувствительность L-треониндегидратазы (синтезирующего фермента) к мультивалентной репрессии конечным продуктом реакции (L-изолейцином, 1,-лейцином, L-валином). Для такой репрессии требуется присутствие всех трех аминокислот.
Культура 1:200 мл минимальной среды и 0,02 М глюкоза.
Культура 2:200 мл минимальной среды, 0,02 М глюкоза, 0,8 мМ L-валин, 0,4 мМ L-лейцин и 0,4 мМ L-изолейцин.
Культура 3 :200 мл минимальной среды, 0,02 М глюкоза, 0,8 мМ L-валин, 0,4 мМ L-лейцин и 0,15 мМ L-изолейцин.
С помощью описанного выше теста на треониндегидратазу измеряют удельную активность фермента в клетках, выращенных в течение ночи в трех описанных выше средах. В культуре 2 должна выявляться более низкая ферментативная активность, чем в культуре 1. Культура 3 будет подвергаться дерепрессии относительно культуры 2 из-за постепенного снижения внутриклеточной концентрации L-изолейцина (содержание L-изолецина в культуре 3 понижено с самого начала, и, кроме того, его поглощение ингибируется двумя другими аминокислотами).