- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
Вес влажного осадка обычно служит достаточно точным показателем его объема, и в расчетах им можно заменить объем, так как плотность влажных вегетативных бактериальных клеток обычно составляет около 1,02-1,04 г/мл. Однако влажные споры бактерий имеют значительно большую плотность (например, 1,22 г/мл у спор Bacillus stearothermophilus), и вес осадка уже не будет эквивалентен объему. Некоторые включения (например, гранулы поли--гидроксибутирата) вегетативных клеток также имеют относительно высокую плотность во влажном состоянии, что может значительно увеличить разницу между весом и объемом осадка. (Определение объёма осадка - см. ПРИЛОЖЕНИЕ).
2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
Клеточный осадок, используемый для определения проницаемости, доводят до нужной температуры и смешивают с раствором изучаемого вещества при помощи стеклянной или покрытой тефлоном палочки, не адсорбирующей жидкость: объем раствора должен быть примерно равен объему осадка. Желательно получить достаточное разбавление, чтобы можно было легко определить разницу концентраций. После перемешивания осадка и раствора суспензию инкубируют в течение известного времени при температуре эксперимента, чтобы могло установиться диффузионное равновесие, - обычно от 15 мин до 1 ч. Лучше всего убедиться, что равновесие действительно устанавливается в течение принятого времени инкубации; для этого проводят опыты с различными осадками и разными периодами инкубации.
2.1.1.5 Повторное центрифугирование
После инкубации каждую смесь осадка с испытуемым раствором центрифугируют в течение достаточного времени, чтобы получить для анализа надосадочную жидкость без клеток. Может потребоваться ее дополнительное центрифугирование для осветления.
2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
Концентрации растворенного вещества следует определять и в исходном растворе, который смешивают с клеточным осадком, и в конечном, полученном после повторного центрифугирования. Обычно для этого можно брать небольшие пробы и использовать гравиметрический или рефрактометрический метод. Однако эти методы неспецифичны, и поэтому примесь других веществ, специально добавляемых к суспензии или переходящих в нее из клеток, может создать помехи. В этом случае применяют более специфические химические или радиоизотопные методы.
2.1.2 Определение межклеточного пространства
Для того чтобы вычислить объем клеток, доступных для проникновения испытуемого вещества, нужно узнать объем межклеточного пространства в осадке. Соответственно один осадок из каждой опытной серии следует смешать с раствором высокомолекулярного полимера, все молекулы которого слишком велики, чтобы пройти через клеточные стенки, и попадают лишь в межклеточное пространство. Лучше всего для этой цели подходит препарат декстрана со средней мол. массой 2000000 (Dextran T2000). Декстраны полидисперсны, но да же наименьшие молекулы столь высокомолекулярного препарата не проходят через клеточные стенки бактерий.
Вместо декстранов можно использовать некоторые другие полимерные молекулы. Белки (например, сывороточный альбумин) имеют то преимущество, что они в основном монодисперсны и поддаются специфическому анализу. Недостаток же их в том, что они могут связываться с клетками, и это приводило бы к получению завышенных величин поглощения. Использовали также инсулин, но он способен проникать через клеточные стенки многих бактерий, особенно грамположительных.