- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
Во многих случаях при изучении транспорта желательно отделить собственно транспортный процесс от последующего метаболизма, особенно в тех случаях, когда нужно продемонстрировать концентрирующее поглощение. В отношении фосфотрансферазных систем полная диссоциация двух процессов невозможна. Существуют три основных способа отделения транспорта от метаболизма:
1) с помощью неметаболизируемых, но транспортируемых аналогов;
2) путем использования мутантов с блокированным метаболизмом, но сохраненным транспортом;
3) с помощью мембранных везикул, не содержащих цитоплазматических ферментов.
Список некоторых часто используемых аналогов приведен в табл.3.
Таблица 3 – Примеры неметаболизируемых аналогов, используемых для изучения транспорта у бактерий
Метаболизируемый субстрат |
Аналоги |
Лактоза (β-галактозид) |
Тиометилгалактозид Тиодигалактозид Тиофенилгалактозид Изопропилтиогалактозид |
Глюкоза |
2-Дезоксиглюкоза α-Метилглюкозид |
Глицин |
α-Аминоизобутират |
Аланин |
|
Фенилаланин |
n-Фторфенилаланин |
К+ |
Rb+ |
2.3.4 Применение мутантов бактерий с блокированным метаболизмом
Мутанты Salmonella typhimurium применялись для изучения транспорта гистидина у этих бактерий. Широко используются для исследования транспортных процессов мутанты zy+ E. соli, лишенные β-галактозидазы, но сохраняющие систему транспорта для β-галактозидов. Мутантные штаммы хранятся в коллекциях генетически маркированных культур.
2.3.5 Мембранные везикулы
Первый этап получения мембранных везикул при изучении транспорта обычно состоит в превращении изучаемых бактерий в осмотически чувствительные формы; последние подвергают лизису в условиях, при которых возможно образование везикул. Сферопласты грамотрицательных бактерий, например Е. соli, можно получить, обрабатывая клетки лизоцимом и ЭДТА; при такой обработке внешняя мембрана клеточной стенки остается на сферопласте. Протопласты грамположительных бактерий часто можно полностью освободить от структур клеточной стенки путем обработки клеток муралитическим ферментом. Для Bacillus теgaterium, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis и М. lysodeikticus использовали лизоцим, для Staphylococcus aureus - лизостафин.
Возможны различные варианты методик выделения везикул, и для выбора оптимальной процедуры применительно к конкретному организму нужны предварительные опыты.
Непрерывность мембраны везикул лучше всего можно проверить, определив степень набухания или сжатия последних при изменении осмоляльности суспендирующей среды. Для этого можно использовать различные методы, включая определение изменений светорассеяния. Функциональное состояние везикул испытывают, определяя их способность к транспорту растворенных веществ, например пролина.