- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.1 Проницаемость бактерий
2.1.1 Методика измерения
Проникновение растворенного вещества в бактериальные клетки или клеточные структуры чаще всего измеряют с помощью объемного метода или метода концентрированной взвеси. В этом случае используют обычно большие массы клеток - 3 г и больше (влажных клеток) на пробирку. Получение такого количества клеток может представлять проблему, однако не слишком сложную при использовании обычных лабораторных культур. Методы, требующие меньшего количества клеток, основаны на применении мембранных фильтров или мини-центрифуг. В любом случае следует уделять внимание деталям, касающимся выращивания и сбора клеток, так как проницаемость бактерий может сильно изменяться в течение цикла развития периодической культуры или в результате отмывания клеток от компонентов среды. Часто удобнее использовать клетки, полученные в результате непрерывного культивирования. Изменения среды, ее температуры, рН и т. д. тоже могут приводить к изменению проницаемости.
Объемный способ предназначен специально для того, чтобы определять, в какую долю объема (пространства) клеток может проникать изучаемое растворенное вещество. Этот метод основан просто на оценке степени разбавления раствора этого вещества после смешивания его с клетками, осажденными центрифугированием. Необходимы следующие данные:
начальный объем и начальная концентрация изучаемого раствора;
объем осажденных клеток;
конечная концентрация растворенного вещества во внеклеточной фазе смеси осадка и раствора.
Клеточный осадок состоит не только из клеток, но и из межклеточного пространства. Объемную долю межклеточного пространства обычно определяют с помощью растворимых высокомолекулярных полимеров, способных проникать в межклеточное пространство, но не в клетки.
Методика включает следующие этапы.
2.1.1.1 Отмывание клеток
Перед определением проницаемости собранные клетки необходимо отмыть. Однократное промывание большим количеством жидкости обычно позволяет в основном отмыть клетки от компонентов среды, но не удаляет из них в достаточной мере внутренние растворенные вещества. Часто требуется двукратное отмывание, трехкратное же вряд ли оправданно. Клетки многих бактерий, особенно грамположительных, достаточно устойчивы и не подвергаются существенному повреждению при отмывании водой или разбавленными буферными растворами, в особенности охлажденными. Однако многие бактерии - прежде всего грамотрицательные - гораздо чувствительнее, и промывание водой может привести к сильному повреждению клеток. К тому же при отмывании клеток грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий часто наиболее эффективны теплые, а не охлажденные жидкости. Растворы, чаще всего применяемые для отмывания грамотрицательных бактерий, содержат ионы магния (обычно 50 мМ), буфер (например, 50 мМ фосфатный буфер или трис-буфер) и осмотический стабилизатор (например, 0,4 М NaCl или 0,5 М сахарозу).
2.1.1.2 Центрифугирование клеток
После отмывания клетки центрифугируют для получения достаточно плотного осадка. Режим центрифугирования зависит от конкретной культуры. При подготовке суспензии для исследования проницаемости клетки нужно центрифугировать значительно дольше того времени, при котором начинается горизонтальный участок кривой, чтобы небольшие отклонения во времени центрифугирования не влияли на вес осадка. Последнее центрифугирование перед добавлением растворенного вещества обычно проводят в тарированной центрифужной пробирке, для того чтобы можно было определить вес осадка.