- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
2.1.4 Общие замечания
Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендует во всех случаях считать единицей ферментативной активности количество микромолей субстрата, потребляемого в 1 мин (или продукта, образующегося в 1 мин). На практике, однако, активность ферментов часто выражают в других единицах, взятых из оригинальных статей, опубликованных в различных журналах. Поэтому и в описанных ниже методиках приводятся различные единицы активности (в том виде, в котором они даются авторами). Однако, где это возможно, следует использовать активность ферментов в международных единицах. Каждая методика определения активности ферментов была разработана (в большинстве случаев) для определения конкретного фермента в данной бактерии (в частности, Е. соli, поэтому не будет излишним подчеркнуть, что условия, необходимые для получения максимальной активности фермента у бактерии одного вида, не обязательно окажутся оптимальными для того же фермента у бактерии другого вида. Применение методик без учета конкретных особенностей бактерий может привести к ошибочным выводам.
2.2. Общие меры по стандартизации
При определении удельной активности фермента в клетках необходимо учитывать ряд факторов. Прежде всего, следует использовать насыщающие концентрации субстратов. В этом случае возможно определение количества единиц ферментативной активности, присутствующих в данном препарате, при условии линейной зависимости активности как от времени реакции, так и от количества присутствующего фермента. Выполнение этого условия проверяют эмпирически для каждого случая. В описываемых ниже экспериментах наглядно демонстрируется, какие именно способы применяют обычно для этой цели, а также каковы различия между ферментативной и удельной ферментативной активностью. Для опытного сотрудника эта разница очевидна, но для начинающего студента она может стать источником значительных затруднений.
2.3 Общие методики
Невозможно описать подробно все многочисленные способы определения различных ферментов. Достаточно сказать, что анализ может быть непрерывным, когда за реакцией наблюдают, не нарушая ее хода, или периодическим, т. е. связанным с периодическим отбором проб для измерения потребления субстрата или образования продукта. Например, фумаразу можно определять с помощью непрерывного анализа, применяя прямое спектрофотометрическое измерение или метод сопряжения с другой ферментативной системой. Предпочтительнее, однако, применять метод с периодическим отбором проб. Его осуществляют с помощью самых разнообразных способов, включая спектрофотометрический, манометрический, полярометрический и хроматографический. Проводят измерения также с помощью электродов и с использованием широкого набора химических агентов и изотопов.
С некоторыми из этих способов можно познакомиться самостоятельно на примере методик, в которых определяют активность ферментов каждого из шести классов: оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз. Ферменты каждого из этих классов участвуют в регуляторных процессах метаболизма микроорганизмов.