- •Основы регуляции метаболизма у микроорганизмов (специальность "Микробиология")
- •Занятие 1
- •1. Подготовка бактериальных клеток к анализу
- •1.1 Интактные клетки
- •1.1.1 Растущие клетки
- •1.1.2 Покоящиеся клетки
- •1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки
- •1.2 Проницаемость клеток
- •1.2.1 Обработка растворителями
- •1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
- •1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
- •1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
- •1.3.2 Дезинтеграция
- •2. Методы изучения метаболической активности микроорганизмов
- •2.1 Экспериментальные условия
- •2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента
- •2.1.2 Подавление активности
- •2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ
- •2.1.4 Общие замечания
- •2.2. Общие меры по стандартизации
- •2.3 Общие методики
- •3. Решение расчётных задач
- •1. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция активности ферментов
- •1.1 Методы изучения аллостерической регуляции метаболизма микроорганизмов.
- •1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом
- •1.2 Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов с помощью ковалентной модификации ферментов
- •1.2.1 Аденилирование
- •2. Методы изучения регуляции метаболизма микроорганизмов. Регуляция синтеза ферментов
- •2.1 Индукция синтеза бактериальных ферментов
- •2.2 Репрессия бактериальных ферментов конечным продуктом реакции (орнитин - карбамоилтрансфераза)
- •2.4 Индукция плюс репрессия (lac-оперон)
- •3. Решение расчётных задач
- •1 Анализ путей метаболизма
- •1.1 Общие методы
- •1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов
- •1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма
- •1.1.3 Использование аналогов субстрата
- •1.1.4 Одновременная адаптация
- •1.1.5 Использование клеточных экстрактов
- •1.1.6 Использование радиоизотопов
- •1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов
- •1.2 Баланс изотопного углерода
- •1.2.1 Общие замечания
- •1.2.2 Определение неиспользованного субстрата
- •1.2.3 Определение ассимилированного 14с
- •1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов
- •1.2.5 Расчет и определение баланса
- •1.3 Наличие ключевых ферментов
- •2.1 Проницаемость бактерий
- •2.1.1 Методика измерения
- •2.1.1.1 Отмывание клеток
- •2.1.1.2 Центрифугирование клеток
- •2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка
- •2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.1.1.5 Повторное центрифугирование
- •2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества
- •2.1.2 Определение межклеточного пространства
- •2.2. Транспорт веществ в клетки бактерий
- •2.2.1 Методика анализа
- •2.2.1.1 Подготовка клеток
- •2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование
- •2.2.1.3 Отбор проб и разделение
- •2.2.1.4 Отмывка клеток
- •2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества
- •2.2.2. Общие замечания
- •2.3. Специальные методы изучения регуляции метаболизма
- •2.3.1. Определение протонодвижущей силы
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •2.3.2 Осмотически чувствительные клетки
- •2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий
- •2.3.5 Мембранные везикулы
- •3. Решение расчётных задач
- •2,3Rt/f[log(с1ввешн)/(с1внутр)],
- •Библиографический список
1.2 Проницаемость клеток
Работа с интактными клетками имеет свои трудности. Главная трудность заключается в том, что как растущие, так и покоящиеся клетки непроницаемы для большинства субстратов, кофакторов и метаболитов, обычно используемых при определении ферментов. Принято считать, что лучше всего изучать ферментативные реакции в условиях, когда белок-белковые (или белок-мембранные) взаимодействия между молекулами одного фермента (гомологичные взаимодействия) или между молекулой данного фермента и молекулой другого белка (гетерологичные взаимодействия) подобны тем, которые существуют in situ. Хотя при использовании интактных клеток данное условие выполняется, это малоутешительно, если необходимые субстраты не могут проникать через клеточную мембрану.
1.2.1 Обработка растворителями
Существует ряд методик, позволяющих более или менее успешно делать целые клетки более проницаемыми и тем самым использовать их для исследования ферментов. Например, при обработке клеток Е. coli растворителями (толуолом или бензолом) они становятся проницаемыми для β-галактозидов, которые проникают в клетки и подвергаются гидролизу (3-галактозидазой. Растворители применяются также при определении фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы у Е. coli. Для обработки клеток используются также различные растворы толуола в этаноле. Иногда такая обработка сопровождается замораживанием и оттаиванием клеток.
1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами
Обработка энтеробактерий хелатобразующим агентом (трис-ЭДТА) была успешно применена для того, чтобы сделать их проницаемыми и, следовательно, чувствительными к актиномицину D. Рекомендуется шире применять такую обработку при изучении сложных систем, таких, как ферменты, связанные с мембранами, и ферменты взаимопревращения. Более того, везде, где это возможно, следует сравнивать ферментативные активности обработанных и интактных клеток.
1.3 Препараты дезинтегрированных клеток
Во многих случаях целые клетки, как проницаемые, так и непроницаемые, бывают непригодны или слишком сложны для исследований, и тогда приходится прибегать к дезинтегрированным клеточным препаратам.
1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил
Бактериальные клетки разрушают различными способами. Пожалуй, самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием гидростатического (осмотического) давления. Для большинства бактерий этот метод неприменим, если не обрабатывать предварительно клеточные стенки ферментами или не изменять их структуру другими способами.
Применение осмотического шока оказалось очень полезным при изучении некоторых ферментов грамотрицательных бактерий. Эти ферменты локализуются между плазматической мембраной и наружными слоями клеточной стенки в периплазматическом пространстве, и поэтому их называют «периплазматическими» ферментами. Обычно это гидролазы, такие, как щелочная фосфатаза, рибонуклеаза I и циклическая фосфодиэстераза. Метод включает следующие этапы:
1) тщательное промывание клеток свежей средой или соответствующими буферами;
2) суспендирование промытого осадка клеток в растворе 0,5 М сахарозы (80 частей);
3) центрифугирование и декантирование надосадочной фракции;
4) быстрое диспергирование осадка путем сильного встряхивания в холодном 5-10-4 М растворе MgCl2 (80 частей);
5) центрифгирование и изучение надосадочной фракции с целью выявления периплазматических ферментов.
Обработка смесью лизоцим - ЭДТА также является прекрасным способом быстрого и мягкого лизиса грамотрицательных клеток. Ее проводят при низкой или комнатной температуре. В осмотически щадящей среде (для того, чтобы не произошло полного разрушения клеток) при этом образуются сферопласты. Таким способом можно одновременно обрабатывать до 30 л клеток. С помощью этой мягкой обработки можно выделить всю фракцию полирибосом. Для оптимального раз рушения клеток бактерий различных видов используют разные концентрации растворов буфера, ЭДТА и лизоцима. Приведенная ниже методика первоначально была описана Репаске для разрушения клеток Е. coli. Промытые клетки суспендируют в 3 мл смеси, содержа щей 100 М трис-HCl, рН 8,0, 0,8 мг ЭДТА, рН 7,5, 50 мкг лизоцима и воду. Лизис начинается после добавления лизоцима; его можно проводить при комнатной температуре в течение 5 мин или же на холоду.
Мягкая осмотическая обработка применяется также при выделении протопластов и мембранных везикул грамположительных бактерий. Выделенные с ее помощью препараты чрезвычайно полезны при изучении транспорта веществ через бактериальную мембрану.