3. Определение лизоцима молока

Из каждой четверти вымени в конце доения в стерильные про­бирки надаивают по 5—10 мл молока. На подсушенный МПА рН 7,2 в чашках Петри (по одной на каждую корову) высевают суточ­ную бульонную культуру золотистого стафилококка штамма ВМ. Для этого культуру разводят физиологическим раствором 1 : 10 000, по 0,3—0,4 мл равномерно распределяют на агаре в чашках и ос­тавляют на 30—40 минут на горизонтальной поверхности. В агаре каждой чашки делают 4 луночки диаметром 10 мл (пробочником № 5). В каждую луночку вносят стерильной пипеткой по 0,1 мл (2 капли) молока. Чашки выдерживают при комнатной темпера­туре (18—22°) 18 часов, а затем помещают в термостат на 5—6 ча­сов. Если молоко содержит лизоцим М, то вокруг луночки наблю­дается задержка роста стафилококков в виде кольца. По диаметру кольца задержки роста микроба определяют титр лизоцима в моло­ке. Задержка роста меньше 16 мм — молоко от коровы, больной маститом, 17—24 мм — сомнительное, более 25 мм — от здоровой коровы.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Для выявления и дифференциации основных возбудителей ма­ститов необходимо проводить бактериологическое исследование сек­рета вымени.

Молоко (секрет) для бактериологического исследования отби­рают непосредственно после доения в стерильные флаконы или пробирки с ватными пробками с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием молока (секрета) подмывают вымя и вы­тирают чистым полотенцем. Соски коровы и руки доярки протира­ют ватным тампоном, смоченным 70%-ным денатурированным спиртом. Нельзя допускать, чтобы сосок касался края посуды. Пробы отправляют в ветеринарную лабораторию, где их иссле­дуют на:

1. наличие основных возбудителей мастита (патогенных стафилококков и агалактийного стрептококка);

2. чувствительность микрофлоры молока (секрета) к антибиотикам.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ'МИКРОФЛОРЫ МОЛОКА К АНТИБИОТИКАМ

Исследуемое молоко с соблюдением стерильных условий раз­ливают по 2 мл в стерильные пробирки. Пробирок должно быть на две больше, чем дисков с антибиотиками.

В одной из пробирок определяют реакцию (рН) молока и до­бавляют в него 0,1 мл бромтимолблау (раствор бромтимолблау готовят так же, как и для диагностики маститов). В зависимости от рН молока смесь окрашивается от желтого (кислое молоко), салатного, зеленого до синего (щелочное молоко) цвета. Записав результат (цвет смеси), данную пробу исключают из опыта* В оставшиеся пробирки (кроме одной) добавляют по одному диску того или иного антибиотика.

Все пробирки с молоком выдерживают при 37° в течение 18— 20 часов в термостате или автоматически регулируемой водяной бане, после чего во всех пробирках проверяют кислотность молока раствором бромтимолблау.

Если кислотность молока в пробирке без антибиотиков до опы­та и после выдерживания в течение 18—20 часов в термостате одинакова, патогенных бактерий в молоке нет. При наличии мик­рофлоры кислотность молока в пробирке без антибиотиков после выдерживания в термостате увеличивается. В этом случае прове­ряется кислотность молока в пробирках с антибиотиками.

Если кислотность молока с тем или иным антибиотиком (после выдерживания в термостате) не выше первоначальной (до выдер­живания в термостате), значит, бактерии, находящиеся в молоке, высокочувствительны к данному антибиотику. Наоборот, если кис­лотность молока в пробирках с антибиотиками после выдержива-

ния в термостате увеличивается, из этого следует, что находящие­ся в молоке бактерии устойчивы к данному антибиотику, причем чем выше кислотность молока, тем устойчивее микроорганизмы.

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА (СЕКРЕТА) НА НАЛИЧИЕ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОКОВ И АГАЛАКТИЙНЫХ СТРЕПТОКОККОВ

Доставленные в лабораторию пробы молока (секрета) после смешивания высевают по 0,1 мл на мясопептонный агар, содер­жащий 5%; отмытых эритроцитов барана (коровы), или на элек­тивные среды: мясопептонный агар, содержащий 7,5% поваренной соли и 5% отмытых эритроцитов барана (коровы) для выделения стафилококков и среду В. М. Карташовой для индикации стреп­тококков. При отсутствии элективных сред можно использовать только 5%-ный кровяной МПА.

Для получения изолированных колоний 1—2 капли секрета на­носят на край пластинки питательной среды в чашке Петри и рас­тирают ее по всей пластинке шпателем (согнутая над пламенем пастеровская пипетка). Засеянные чашки (крышкой вниз) выдер­живают при температуре 37° в течение 24 часов. Если на чашках получена однородная по морфологии популяция, для дальнейшего исследования достаточно брать по одной колонии с чашки. Если колонии на чашке различны по форме, размерам, окраске, типу гемолиза, следует брать по одной колонии каждого образца. Ото­бранные колонии отсевают и подвергают дальнейшему иссле­дованию.

Исследование на наличие стафилококков

Большие и средние колонии белого, кремового и лимонно-желтого цвета, образующие хорошо выраженную зону гемолиза эри­троцитов на кровяном агаре или на кровяно-солевом агаре, отсе­вают в пробирки, содержащие 3 мл мясопептонного бульона (лучше предварительно подогретый в термостате) и выращивают при температуре 37° в течение 3—3'/₂ часов до помутнения.

Выросшие молодые бульонные культуры микроскопируют, окрашивая по Граму. При обнаружении стафилококков определяют их патогенные свойства реакцией плазмокоагуляции, лизоцимную, дезоксирибонуклеазную (ДНК-азной) активность и отношение к манниту, из которых реакции плазмокоагуляции и гемолиза стро­го обязательны.

Пропись кровяно-солевого агара

Готовый (стерилизованный в автоклаве) МПА, содержащий 7,5 % хлористого натрия, растапливают и охлаждают до 45°. При­бавляют 5% отмытых эритроцитов барана или крупного рогатого скота, перемешивают, избегая образования пены, и разливают в чашки Петри. Среду можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.

Реакция плазмокоагуляции

Кровь, взятую из сердца кролика, выливают в пробирку со сте­рильным раствором лимоннокислого натрия и центрифугируют. Полученную плазму разводят стерильным физиологическим рас­твором в соотношении 1 : 4 и разливают в агглютинационные про­бирки по 0,5 мл. 12—18-часовую бульонную культуру испытуемого стафилококка вносят по 2 капли в пробирки с разведенной плаз­мой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культу­ры, а в другую засевают заведомо илазмокоагулирующий стафи­лококк. Пробирки помещают в термостат при 37° и через каждый час в течение 3 часов учитывают результаты. При положительной реакции образовавшийся сгусток не ныпадает из пробирки даже при переворачивании или плавает в плазме.

Указанный метод определения патогенпостн стафилококков ос­новной. При необходимости можно пользоваться и другими тестами.

Определение л и з о ц и м н о й а к т и в и о с т v стафилококков

В качестве тест-культуры используют взвесь живой или убитой 15-минутным кипячением культуры Micrococcus lysodeicticus. Преимущество использования убитой культуры в том, что в этом случае можно пользоваться стандартным препаратом (взвесь уби­тых микробов можно хранить в холодильнике в течение месяца и более).

В пробирки с 15 мл растопленного и охлажденного до 50^J 0,7%-ного агара, приготовленного на переваре Хотингера, вносят взвесь убитой культуры микрококка из расчета 1 млрд. микроб­ных клеток на 1 мл среды (по оптическому стандарту). При ис­пользовании живой культуры на 1 мл среды добавляют 100 млн. микробных тел. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри и на поверхность застывшего и подсушенного агара бляшками (размазанная петлей капля) наносят 3—4-часовые бульонные культуры испытуемых штаммов стафилококков. На одной чашке можно испытать 7—8 штаммов.

После инкубации посевов в течение суток при 37° вокруг бля­шек с ростом культур, продуцирующих лизоцим, появляются зоны лизиса, которые значительно увеличиваются после дополнительно­го пребывания посевов при комнатной температуре в течение 48 часов.

Определение дезоксирибонуклеазной (ДНК-азной) активности стафилококков

К 150 мл расплавленного стерильного готового 2%-ного МПА (рН 8,6) добавляют 300 мг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), то есть 2 мг/мл, предварительно растворенной в 15 мл под­щелоченной 3 каплями 10%-ного раствора едкого натрия дистил-

лированной воды. После перемешивания среду прогревают в те­чение ^]/₂ часа в кипящей бане. К немного остывшей среде добав­ляют 1,2 мл 10%-ного стерильного хлористого кальция, разливают в чашки, подсушивают и засевают бульонными культурами (штри­хами). После 18-часовой инкубации при 37° поверхность чашки заливают 7 мл IN HC1, выдерживают 15 минут, сливают кислоту и учитывают результаты. Появление зон просветления (деполиме­ризация ДНК) вокруг культур указывает на положительную ДНК-азную реакцию.

Определение отношения к манниту

3—4 капли испытуемой бульонной культуры стафилококка за­севают на пробирку среды с 0,5% маннита. В качестве такой сре­ды можно использовать полужидкий агар с индикатором ВР (го­товые, сухие среды) или жидкую среду с индикатором Андредэ. Изменение цвета индикатора после 24-часового инкубирования в термостате указывает на ферментацию маннита.

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛОКА (СЕКРЕТА) НА НАЛИЧИЕ ПАТОГЕННЫХ СТРЕПТОКОККОВ

При учете роста колоний на чашках Петри с кровяным или сывороточным агарами (второй день исследования) отсевают ро-синчатые, мелкие однотипные колонии, характерные для роста стрептококков, на элективную питательную среду для стрепто­кокков (среда В. М. Карташовой), которая готовится следующим образом: к 500 мл МПБ с рН 7,2—7,3 добавляют 2,5 г лактозы, 1 мл спиртового или водного раствора 1 : 100 бромкрезолпурпура (1 г порошка растворяют в 50 мл спирта и добавляют 50 мл ди­стиллированной воды). Затем МПБ ставят в водяную баню, до­водят до кипения и кипятят 5—7 минут. После остывания до -50—55° в колбу добавляют 50 мл стерильной сыворотки без кон­серванта и 0,5 мл раствора неомицина, в котором содержится 55 000 ЕД антибиотика (500 000 ЕД неомицина растворяют в 10 мл •физиологического раствора). В стерильных условиях среду разли­вают по 5 мл в пробирки. Цвет ее сине-фиолетовый. Посевы инку­бируют в течение 24 часов при 37°.

Изменение сине-фиолетового цвета среды в лимонный или жел­то-зеленый указывает на рост стрептококков. Из пробирок с изме­ненным цветом среды готовят мазки и окрашивают по Граму. При наличии стрептококков проводится их дальнейшая дифференциа­ция с помощью КАМП-теста.

Постановка КАМП-теста. Суточную культуру бета-гемолитиче­ского стафилококка высевают на агар с 5%| крови крупного ро­гатого скота или барана. Посев делают петлей сплошной линией по диаметру чашки. Перпендикулярно к линии посева стафило­кокка, не доходя 5—6 мм, высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8—

10 культур. Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37", КАМП-тест считается положительным, если четко выражен гемо­лиз испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне бета-гемолитического стафилококка.

Положительный КАМП-тест дают только агалактийные стреп­тококки. На этих же чашках кровяного агара учитывают и тип гемолиза стрептококков. Светлая зона вокруг штриха культуры стрептококков указывает на бета-гемолиз, зеленая зона — на альфа-гемолиз (зеленящие стрептококки).

Для дифференциации непатогенных стрептококков (группа D—фекальные стрептококки и группа N—молочнокислые стрепто­кокки) делают высевы на бульон с 6,5% хлористого натра, на бульон с 40% желчи крупного рогатого скота и на стерильное обезжиренное молоко с добавлением метиленовой сини 1 : 1000 (на 5 мл молока—0,5 мл 1%-ного раствора метиленовой сини). Посевы инкубируют в термостате при 37° и на другой день прово­дят учет по следующей схеме:

Серологиче­ский тип	Наименование стрептококка	Гемолиз		КАМП-тест	Среда Карташовой	МПБ с 6,5% NaCl	МПБ С 40% желчи	Молоко с метиленовой синью 1:1000	МПБ с 0,5% сорбита
		d	β
А	Str. pyogenes	―	+	―	+	―	―	―	―
В	Str. agalactiae	±	±	+	+	―	±	―	―
С	Str. dysgalactiae	+	―	―	+	―	―	―	±
Е	Str. überis	―	+	―	+	―	±	―	+
D	Str. faecalis	―	±	―	+	+	+	+	±
N	Str. lactis	±	―	―	―	―	+	±	―
N	Str. cremoris	±	―	―	―	―	―	+	―