Индикация и идентификация вируса
Обнаружение специфических телец-включений. Это наиболее простой, предпочтительный и легко осуществимый в практических условиях метод микроскопии мазков-отпечатков или гистосрезов, приготовленных из пораженных участков плаценты, паренхиматозных органов плода, влагалищных выделений и крови, так как вирус РПЛ вызывает образование характерных внутриядерных эозинофильных телец-включений в тканях и органах абортированных плодов (печени, легких, селезенке, слизистой оболочке носовой полости), в клетках печени хомячков, мышат-сосунов или морских свинок, зараженных материалов больных животных, а также в клетках инфицированных культур тканей и КЭ. Наиболее подходящий для гистологического исследования материал - ткань печени. При микроскопии в положительных случаях в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, обнаруживают многочисленные некротические фокусы и эозинофильные внутриядерные тельца-включения в клетках печени, бронхиол и альвеол.
Аналогичные тельца-включения можно обнаружить при исследовании ХАО инфицированных КЭ и культур клеток. Появление телец-включений в культуре клеток и КЭ предотвращается специфической антисывороткой. Обнаружение характерных ацидофильных внутриядерных телец-включений имеет важное диагностическое значение.
Биопроба. (См. экспериментальная инфекция и заражение лабораторных и естественно восприимчивых животных).
РГАд. Применяют для индикации вируса в культуре клеток, инфицированных испытуемой суспензией. Для этого из 4 пробирок с выраженным ЦПД сливают питательную среду, вносят по 1 мл 2%-ной взвеси эритроцитов лошади, оставляют на контакт (30-40 мин) при 37˚C. Эритроциты сливают, культуру отмывают физиологическим р-ром и просматривают под микроскопом. При положительной РГАд идентификацию вируса проводят в РТГАд.
Идентификация в ИФА. Предложено выявление АГ в фиксированных формалином парафиновых срезах ткани печени абортированных плодов с использованием метода пероксидаза - антипероксидаза (ПАП). Данный метод подходит для выявления вируса в инфицированных тканевых культурах. Метод дот-блот-гибридизации перспективен для быстрой диагностики РПЛ и изучения патогенеза герпесвирусной инфекции лошадей.
Серологическая идентификация
ИФ. Ею пользуются для быстрого обнаружения специфического АГ возбудителя РПЛ. В мазках отпечатках из носовой полости вирусный АГ обнаруживается в течение 3-10 дн после заражения, а в культуре клеток - в течение 4-10 дн. Рекомендуется использовать препараты приготовленные из легких и тимуса. Результаты ИФ коррелируют с данными вирусологических и гистологических исследований. Для идентификации вируса культуру клеток выращивают на покровных стеклах и через 2-3 дн после заражения стекла с инфицированными клетками извлекают из пробирок, фиксируют в охлажденном ацетоне и окрашивают методом по общепринятой методике. В положительных случаях вирусный АГ выявляется в виде ярко-зеленого свечения в перинуклеарной зоне не менее 50% клеток при отсутствии флюоресценции в контрольных незараженных препаратах.
РСК. Используют для обнаружения КС АГ в патологическом материале. Для индикации вирусного АГ используют ткани абортированного плода, которые замораживают и хранят при -20 °С до гистологического подтверждения диагноза. АГ для РСК готовят из легкого или печени абортированного плода, образцы которого в замороженном состоянии сохраняют активность до 18 мес.
РН. Ставят по общепринятой методике в культуре клеток, используя тот же вид клеток, на которых был выделен вирус. Специфическую и контрольную (отрицательную) сыворотки инактивируют при 56°С в течение 30 мин. Для идентификации выделенного вируса реакцию ставят с постоянной дозой гипериммунной сыворотки (обычно в разведении 1:20) и серийным 10-кратными разведениями вируса. В контроле вирус титруют в присутствии разведенной 1:20 нормальной кроличьей сыворотки. Результаты реакции учитывают на 2, 3 и 6-е сут по ЦПД, определяя индекс нейтрализации по разнице титров вируса с гипериммунной и нормальными сыворотками и вычисляя его по методу Рида и Менча или Кербера. Вирус считают идентифицированным, если индекс нейтрализации более 2 lg.
ПЦР. Высокочувствительный метод диагностики, с помощью которого удается обнаружить ГВЛ в патологическом материале даже когда в 105-106 клеток было не более одного генома вируса. ГВЛ типа 1 способен длительное время находиться в лейкоцитах в латентном состоянии.