3. Актуальные направления

Многие оставшиеся без ответа вопросы явно требуют к себе внимания. Хотя многие маршруты могут быть связаны с экспрессией или активностью PGC-1а или активности, которые из них действуют в скелетных мышцах в ответ на внешние сигналы, пока неясно. Например, как лишение кислорода и питательных веществ индуцирует PGC-1a, а именно то какие маршруты индуцируют PGC-1а во время упражнений остается лишь отчасти понятным. Как PGC-1а интегрирует эти многочисленные поступающие сигналы, также нуждается в дальнейшем исследовании. Например, недостаток кислорода / питательных веществ каким-то образом вызывает индукцию PGC-1 и активирует ее ангиогенные программы, но не биогенез митохондрий. Пост-трансляционная модификации PGC-1, вероятно, играют важную роль. Предполагается что роль PGC-1а в тренировке выносливости заключается в индукции ангиогенеза и биогенеза митохондрий и преобразования типов волокон, что также ожидает официального подтверждения. Наконец, воздействия, которые производит PGC-1a на мышцы, по-видимому, имеют существенное влияние на отдаленные ткани, и что представляют собой эти эффекты, и как происходит взаимное сообщение органов, только начинают рассматриваться. Возможно, особенно заманчивой является противовоспалительная роль PGC-1 [41].

Несмотря на множество безответных вопросов, ясно то, что мощные способности PGC-1a и P к перепрограммированию многочисленных аспектов функционирования скелетных мышц. Улучшение физической формы, индукция ангиогенеза и защиты от атрофии и дистрофии особенно важны. Способность PGC-1 к комплексному управлению крупных программ экспрессии генов делает их привлекательными узловыми точками для фармацевтического вмешательства. Например, клинические испытания на человеке, использования VEGF для лечения хронической ишемии нижних конечностей дали неутешительный результат [33], вероятно, отчасти потому, что VEGF в одиночку не способна генерировать полностью функциональные сосуды. PGC-1a, с другой стороны, по-видимому активирует полномасштабную и комплексно управляемую программу ангиогенеза, включая индукцию VEGF а также ряд ангиогенных факторов, таких как ангиопоэтин 2 и PDGFB [32]. Таким образом, независимо от своей роли в обеспечении физиологичной мышечной пластичности, препараты, которые индуцируют какой либо из коактиваторов PGC-1, могут улучшить множество мышечных патологий, от периферических патологий сосудов до миодистрофии Дюшенна. Интенсивные исследования подобных препаратов усиленно осуществляются.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Культивирование клеток

Реактивы:

1. Среда для культивирование DMEM

2. Фосфатно-солевой буфер

3. 0,05% раствор трипсина

4. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)

5. РНК-сохраняющий раствор EverFresh

Оборудование:

Ход работы:

Культивация клеток проводилась в испытательной лаборатории биологической активности и токсикологической безопасности ОАО «Завод экологической техники и экопитания ДИОД»

Для получения образцов РНК использовалась культура клеток Hela. Клетки HeLa культивировали в среде DMEM с 0,3 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Cibro BRL, США), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в контролируемых условиях (+37⁰С, 5% СО₂) в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см² (посевная концентрация 1х10⁶ клеток/флакон).

Непосредственно перед тестированием клеточный монослой 2 раза промывали фосфатно-солевым буфером без ионов кальция и магния, после чего заливали на 5 минут 0,05% раствором трипсина (1 мл раствора на флакон). Затем инактивировали трипсин средой для культивирования клеток DMEM, осторожно пипетировали клетки в среде до образования однородной суспензии. После чего клетки осаждали центрифугированием (5 мин 400g). После этого клетки еще 2 раза отмывали в охлажденном растворе фосфатно-солевого буфера и ЭДТА (+4°С).

Жизнеспособность клеток оценивалась окраской 0,4% трипанового синего. Суспензию клеток разводили до концентрации 1х10⁷ кл/мл (подсчет клеток осуществлялся в камере Горяева). Хранение клеток возможно при температуре +4°С не более 3 часов.

Для лучшего сохранения РНК суспензия клеток заливалась тройным объемом раствора EverFresh.