3. Основные приборы, используемые в практикуме
При проведении биохимических исследований используются различные приборы и оборудование, позволяющие выделить изучаемое вещество и определить его содержание в биологическом материале.
Фотометрические приборы
Фотометрия (абсорбциометрия) – метод качественного и количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока.
Светопоглощение или экстинкция, согласно закону фотометрии Ламберта-Бугера-Бера прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту экстинкции (Е). Последний представляет собой поглощение раствора вещества концентрацией 1моль/л, помещенного в кювету с толщиной слоя 1см, и измеряется в л·моль-1·см-1.
Рис. 1. Общий вид колориметра фотоэлектрического концентрационного
1 – гальваномер; 2 – крышка кюветного отделения; 3 – ручка установки «грубо»;
4 – ручка установки «точно»; 5 – ручка чувствительности; 6 – ручка кюветодержателя; 7 – переключатель светофильров.
Часто используют и другой показатель – удельный коэффициент экстинкции Е1см1%, т.е. поглощение света 1%-ным раствором вещества в кювете с толщиной слоя 1см. Для определения содержания какого-либо компонента биологического материала строят калибровочный график, отражающий зависимость между экстинкцией (Е) и концентрацией (С) этого вещества в растворе и представляющий собой прямую линию в прямоугольной системе координат.
Для фотометрического анализа используют фотоэлектроколориметры, фотоэлектроколориметры-нефелометры и спектрофотометры.
Фотоэлектроколориметры (ФЭК) различных моделей применяют для анализа светопоглощения окрашенных растворов веществ в видимой области спектра (рис.1).
Фотоэлектроколориметры-нефелометры применяют для измерения интенсивности светорассеивания или ослабления светового потока изучаемых веществ в мутных средах.
Колориметр фотоэлектрический концентрационный позволяет благодаря большому набору узкополосных светофильтров проводить измерения в определенной области спектра в диапазоне длин волн 315-980 нм. Этот прибор используют для определения светопоглощения веществ, а также коэффициент пропускания рассеивающих взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. Порядок работы изложен в инструкции.
Рис. 2. Общий вид спектрофотометра.
Спектрофотометры (рис.2) используют для изучения строения, качественного и количественного анализа вещества по интенсивности поглощения его в монохроматическом свете. В клинико-биохимических и научных исследованиях широко применяются спектрофотометры СФ-16, СФ-26, СФ-46 и их современные модификации, работающие в области спектра от 186 до 1100 нм.
Правила работы на спектрофотометре изложены в инструкциях к прибору.
Флуориметрические приборы
Для качественного и количественного анализа веществ, которые, поглощая энергию, способны к люминисценции (флуоресценции) применяются флуороскопы и флуориметры.
Флуороскоп позволяет проводить полуколичественный анализ путем визуального сравнения интенсивности флуоресценции опытного раствора со стандартным, где концентрация вещества известна.
Флуориметры позволяют проводить количественный анализ. В этих приборах выделение области спектра, необходимого для возбуждения данного вещества, осуществляется первичными светофильтрами, а пропускание характерного для него участка излучения (свечения) – с помощью вторичных светофильтров.