Энергетический обмен (биоэнергетика)

Существует два основных типа энергетики живых организмов – фототрофный и хемотрофный. Первым обладают растения и фотосинтезирующие микроорганизмы, которые преобразуют энергию солнечного света в энергию фосфатных связей АТФ, а вторым – клетки организмов, в том числе человека и животных, использующие для образования АТФ энергию окислительно-восстановительных реакций.

Основная часть энергии в тканях человека и животных образуется аэробным путем в ходе окислительного фосфорилирования в митохондриях. Анаэробное образование энергии происходит в процессе гликолиза (гликогенолиза). Однако он играет вспомогательную роль.

Упрощенно аэробное образование энергии можно представить следующей схемой:

Эффективность этого процесса зависит от активности дегидрогеназного звена (т.е. от наличия субстратов окисления S·H₂ и активности дегидрогеназ), которое обеспечивает поступление водорода, связанного с НАД или ФАД, на дыхательную цепь митохондрий, а также от сопряжения дыхания и фосфорилирования (см. учебник с.204-214).

1. Исследование процессов биологического окисления в животных тканях Работа 39. Обнаружение цитохромоксидазы в мышечной ткани

Цитохромоксидаза, или комплекс цитохромов а + а₃, является заключительным компонентом дыхательной цепи митохондрий животных и растительных клеток. Этот фермент переносит электроны на кислород. Он прочно связан с внутренней мембраной митохондрий и извлекается только при ее разрушении. Цитохромоксидаза может окислять ряд синтетических субстратов, например, α-нафтол и N,N΄-диметил-n-фенилендиамин (реактив НАДИ, названный по первым слогам обоих соединений). Реактив НАДИ используется для обнаружения этого фермента в тканях.

Реактивы. Реактив «НАДИ»^*.

Оборудование. Ступка с пестиком; воронка для фильтрования; фильтровальная бумага; ножницы; стеклянные палочки; марля или бинт; пипетки вместимостью 1 мл; мерный цилиндр; водяная баня; аптечные весы с разновесами.

Материал. Мышечная ткань (свежая) забитого животного.

Метод основан на образовании в ходе реакции окисления диметил-n-фенилендиамина и α-нафтола цитохромоксидазой индофенолового голубого, интенсивность синей окраски которого пропорциональна активности фермента:

Ход определения. 5 г мышечной ткани измельчают ножницами и тщательно растирают в ступке, добавляя порциями 20 мл дистиллированной воды. Мышечную кашицу фильтруют через двойной слой марли и многократно промывают дистиллированной водой до бесцветной окраски промывных вод.

Бесцветную массу, которая содержит цитохромоксидазу, комплекс цитохромов и некоторые дегидрогеназы, отжимают между листами фильтровальной бумаги. Полученный остаток кашицы делят на три части: одну переносят в пробирку, а две другие оставляют на фильтровальной бумаге.

К кашице в пробирке приливают 1 мл дистиллированной воды и кипятят содержимое на водяной бане 1 мин. Пробирку охлаждают, осторожно сливают жидкость и мышечную кашицу с помощью стеклянной палочки переносят на другой лист фильтровальной бумаги.

На первую порцию мышечной кашицы (кипяченую) и вторую (некипяченую) наносят по 2-3 капли реактива НАДИ, третью (тоже некипяченую) – сначала смачивают раствором азида натрия, а через 3 мин на нее наносят 2-3 капли реактива НАДИ. Сравнивают характерные окраски проб.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.

№ пробы	Материал	Фермент	Субстраты	Условия опыта			Окраска пробы
				температурная обработка	ингибиторы

Практическое значение работы. Цитохромоксидаза как гемсодержащий белок очень чувствительна к действию цианидов, сульфидов, азидов и прочих веществ, взаимодействующих с железом гема. При отравлении этими соединениями происходит угнетение цитохромоксидазы и развивается гистотоксическая гипоксия, т.е. кислородное голодание тканей, связанное с невозможностью использовать кислород как акцептор электронов и протонов в дыхательной цепи митохондрий. Метод выявления цитохромоксидазы реактивом НАДИ используется в клинике и цитологии для выявления этого фермента в биоптатах и мазках клеток крови с целью диагностики нарушений тканевого дыхания.