Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови по а.А.Покровскому, а.И.Арчакову и о.Н.Любимцевой

Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 4,0; гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере с рН 4,0^*; трихлоруксусная кислота, 8%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на спектрофотометрическом определении при 280 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза гемоглобина, образующихся под действием катепсинов сыворотки крови.

Реакция протекает по уравнению

Катепсины

Глобин ——————— (n + 1) Фрагменты глобина

+ nН₂О

Экстинкцию кислоторастворимых продуктов гидролиза глобина (пептиды, свободные аминокислоты) измеряют при 280 нм на спектрофотометре. В этой области спектра в основном поглощает тирозин и в меньшей степени триптофан и фенилаланин.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 1 мл раствора гемоглобина и 0,5 мл сыворотки крови, а в контрольную – те же вещества в том же объеме и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивают встряхиванием.

Ставят пробирки на 60 мин в водяную баню при 37˚С, после этого приливают к опытной пробе 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают содержимое встряхиванием. Центрифугируют пробы 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет. Проводят с использованием калибровочного графика на тирозин или молярного коэффициента экстинкции тирозина:

Е5000

х = —————— ,

0,436

где х – активность катепсинов, ммоль тирозина/(ч∙л);

Е – экстинкция опытной пробы против контрольной;

5000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

0,436 – коэффициент экстинкции 1 ммоля тирозина.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать активность катепсинов в сыворотке крови, сделать вывод и отметить практическое значение определения данного фермента.

Практическое значение работы. Катепсины, гидролизующие белки в кислой зоне рН, специфичны для лизосом тканей, поэтому в научных исследованиях их определяют как индикаторы чистоты лизосомальной фракции. При поражении органов, особенно при некрозах, активность катепсинов в сыворотке крови увеличивается. Это явление отмечено при инфаркте миокарда, причем степень повышения ферментативной активности в сыворотке крови зависит от глубины и распространенности некротического очага в сердце.

Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин­- аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

Реактивы. Субстратные растворы № 1 и № 2^*; 2,4-динитрофенилгидра­зин, 0,1%-ный раствор на 2 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении пировиноградной кислоты, которая является одним из продуктов реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой, или продуктом декарбоксилирования оксалацетата, образующегося в реакции, катализируемой аспартатаминотрансферазой. Образовавшаяся пировиноградная кислота определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (см. работу 31).

Ход определения. Определение активности ферментов проводят по схеме

Последовательность операций	АлАТ		АсАТ
	опыт	контроль	опыт	контроль
Внесение субстратных растворов	Раствор № 1 – 0,5мл	Раствор № 1 – 0,5мл	Раствор № 2 – 0,5мл	Раствор № 2 – 0,5мл
Нагревание	5 мин при 37˚С		5 мин при 37˚С
Добавление 2,4-ДНФГ	-	1,0 мл	-	1,0 мл
Добавление сыворотки	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл
Инкубация	30 мин при 37˚С		60 мин при 37˚С
Добавление 2,4-ДНФГ	0,5 мл	-	0,5 мл	-
Экспозиция	20 мин при 18-20˚С		20 мин при 18-20˚С
Добавление гидроксида натрия	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл
Экспозиция	10 мин при 18-20˚С		10 мин при 18-20˚С

Фотометрируют опытные пробы против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет производят по формулам:

m10000 m10000∙2

х(АсАТ) = ———— или х(АлАТ) = ———— ,

1000 1000

где х – активность ферментов, ммоль/(ч∙л);

m – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику (рис. 9), мкмоль;

10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки;

1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

2 – для пересчета на 1 ч.

Практическое значение работы. В норме активность аланинаминотрансферазы составляет 0,1-0,68, а аспартатаминотрансферазы 0,1-0,45 ммоль/(ч∙л).

Определение активности АсАТ и АлАТ и их отношения широко используется в клинической практике для выявления патологических процессов в различных органах. В миокарде более высокая активность АсАТ, чем АлАТ, в печени обратное соотношение активности этих ферментов. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови с одновременным повышением коэффициента АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит и т.д.) более выраженно повышается активность АлАТ и снижается коэффициент АсАТ/АлАТ.