М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Санкт-Петербург, 2002 г.

2

Авторы:	М.С.Поляк, доктор мед.наук, профессор,
	научный директор НИЦФ, зав.лабораторией химиотерапии
	и экспериментальной микробиологии НИТИАФ
	В.И.Сухаревич,	доктор биол.наук, профессор,
		вед.научный сотрудник НИЦФ
	М.Э.Сухаревич,	кандидат биол.наук,
		руков.участка ГПС НИЦФ

Книга издана при содействии Научно-исследовательского центра фармакотерапии (НИЦФ)

Научные редакторы: докт.биол.наук Н.Г.Медведева канд.мед.наук Г.Е.Гефен

© М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич

3

П р ед и с л ов и е

Это небольшое издание адресовано микробиологам медицинских учреждений, чья профессиональная деятельность каждодневно связана с применением разнообразных питательных сред. От качества, от правильного выбора питательных сред, от таких, казалось бы, «частных» моментов, как хранение, стерилизация, лабораторное приготовление и проверка питательных сред зависит эффективность и информативность важнейшего для клиники аналитического исследования.

Вместе с тем, не будет большим преувеличением сказать, что в последние годы в отечественной микробиологической литературе питательным средам не уделялось того внимания, которого они заслуживают. Это касается не только технологии средоварения, она представляет собой большую и самостоятельную тему, но и практики утилизации питательных сред, той информированности медицинских микробиологов о питательных средах, которая необходима для грамотного их использования. В этой ограниченной по формату книге сделана попытка дать ответ на ряд вопросов: что такое микробиологические питательные среды, как и из чего их делают, как оценивают качество, какие среды используют в аналитической медицинской микробиологии. Последнее, естественно, дано только выборочно. На определенных примерах показана отечественная и зарубежная практика, в том числе в таких областях, информация о которых очень бедна (фармакокинетика, биоконтроль, микробиологическая чистота лекарств).

Авторы будут благодарны за все советы и замечания по содержанию этой книги, которые просим направлять по адресу 192236, Санкт-Петербург, ул. Белы Куна, 28.

О гл а вл е н и е

Стр.

Введение Глава 1 Питательные среды и микробный метаболизм

Глава 2 Классификация питательных сред Глава 3 Состав и приготовление питательных сред

Глава 4 Показатели качества и контроль питательных сред. Их хранение Глава 5 Стерилизация питательных сред Глава 6 Базовые питательные среды

Глава 7 Транспортные среды и буферные системы Глава 8 Питательные среды для энтеробактерий Глава 9 Питательные среды для анаэробных бактерий Глава 10 Питательные среды для грибов

Глава 11 Питательные среды для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Глава 12 Питательные среды для определения микробиологической чистоты лекарств

Глава 13 Питательные среды для определения содержания антибиотиков в лекарствах и биологических субстратах

Глава 14 Другие питательные среды (для энтерококков, стафилококков, листерий, кампилобактерий, неферментирующих бактерий)

4

ВВЕДЕНИЕ

Питательные среды без преувеличения могут считаться одним из основных компонентов микробиологических исследований. Современная микробиология без питательных сред существовать не может, а их качество во многом определяет информативность, точность микробиологического анализа. Число включенных в ряд руководств питательных сред (с учетом модификаций) превысило 5000 прописей, причем эта цифра вряд ли может считаться полной.

История этого раздела микробиологической науки возникла одновременно с классическими исследованиями Пастера и Коха. Особая роль принадлежит Роберту Коху. Постулировав необходимость выделения чистой культуры микроба, он тем самым определил необходимость создания условий для решения этой задачи. Важнейшим из них явилась питательная среда, на которой можно было бы получить рост микроорганизма. С именем Коха связывают внедрение в микробиологическую практику в 1881 г. плотных питательных сред. Сама идея их использования возникла раньше и принадлежит немецкому исследователю Бредфельду. Более того, еще в 1877 г. Шретер культивировал бактерии на ломтях картофеля, что также может трактоваться как применение питательной среды. Заслуга Коха заключается в глубоком научном подходе к проблеме, широком использовании питательных сред в собственных исследованиях. Им же предложен первый отвердитель –– желатин, как компонент плотной среды. Привычный для современных микробиологов агар-агар был внедрен Фростом в повседневную практику значительно позже, в 1919 г., хотя справедливо было бы вспомнить, что еще в 1881 г. немецкая исследовательница Хессе предложила агар-агар. Более того, в 1913 г. русский микробиолог В.Л.Омелянский, отдавая должное питательным средам с желатином, отмечал, что агаризованные питательные среды предпочтительнее в тех случаях, когда микроб разжижает желатин.

Идеи и практическая деятельность Коха получили в конце 19 и первой четверти 20 столетий интенсивное развитие. Именно в этот период исследователи ряда стран предложили питательные среды различного назначения, роль которых для практической микробиологии была и остается весьма значительной. Современный микробиолог каждый день в своей работе вспоминает их имена. В эти немногие годы японец по происхождению Ш.Эндо предложил свой агар для дифференциации энтеробактерий, австриец Э.Левенштейн –– среду для микобактерий, англичанин А.МакКонки –– селективную и дифференциально-диагностическую среду для кишечных микроорганизмов, немец Т.Китт и итальянец Д.Тароцци –– среду для облигатно анаэробных бактерий, француз Р.Сабуро, чех Ф.Чапек и американец А.Докс ––– среды для грибов, бразилец Р.Хоттингер –– среды широкого назначения на основе перевара мяса и т.д.

Необходимо отметить вклад отечественных специалистов. С именем С.Н.Виноградского связано конструирование и широкое использование селективных питательных сред. В прошлом веке признание получили среды И.Е.Минкевича, Н.В.Плоскирева, И.И.Рогозина, Г.Н.Чистовича и др. российских микробиологов. К числу крупных отечественных ученых, создателей питательных сред, принадлежит работавший за рубежом А.М.Безредка.

А 20-м столетии проблема микробиологических питательных сред получила дальнейшее развитие. Внедрение противомикробных лекарственных препаратов, в первую очередь антибиотиков, потребовало широкой гаммы питательных сред для культивирования продуцентов, определения антибиотических веществ в ферментационных жидкостях, субстанциях, лекарственных формах и в биологических субстратах (при изучении фармакокинетики антибиотиков), а также для определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным лекарственным средствам.

С особой остротой была поставлена задача стандартизации питательных сред, многие из которых содержат недостаточно стандартные или просто плохо стандартизуемые компоненты. В этой связи все больше заявляют о себе многокомпонентные синтетические питательные среды, одним их родоначальников которых можете быть назван Герберт (1961 г.). Их широкое применение пока сдерживают технологические и экономические вопросы, но перечень сред, содержащих частично или полностью стандартные компоненты, неуклонно увеличивается.

Тем не менее, проблема микробиологических питательных сред, в том числе для клинической практики, остается актуальной, а сама сложившаяся ситуация имеет ряд негативных моментов. Это и уже упомянутая недостаточная стандартность многих питательных сред. Качество серийных образцов в некоторых случаях оставляет желать лучшего, а внутрилабораторный контроль питательных сред, как система, пока не внедрен. Вызывает сожаление узкий круг

5

номенклатуры используемых сред, о некоторых из них, эффективных, с высокой избирательностью ростовых свойств, неправомерно забывают. Безусловно, это чаще всего связано с экономическими причинами. Но, в ряде случаев, отрицательную роль играет информационный вакуум. Питательным средам в руководствах и учебниках по микробиологии уделяется очень мало места. Специалистов данной области микробиологических знаний не готовят.

Вот почему настоящее издание может оказаться полезным и в какой-то, пусть небольшой степени, поможет врачам-микробиологам глубже заглянуть в сложный мир микробиологических питательных сред, напомнит им об основных понятиях и терминах в области средоварения, требованиях к питательным средам, рецептуре ряда наиболее употребляемых вариантов сред.

ГЛАВА 1. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И МИКРОБНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ

Для процессов роста и размножения микроорганизмы должны получать все вещества, которые необходимы для биосинтеза клеточных компонентов и получения энергии. Эти вещества, называемые питательными, должны содержаться в культуральной (питательной) среде, при этом в количествах, соответствующих специфическим потребностям данного микроорганизма.

Питательные среды имеют исключительное значение в микробиологии. Правильный подбор состава среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов, получения чистых культур, изучения их морфологических и физиологических особенностей, идентификации, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний и многое другое.

Так как физиология микроорганизмов крайне многообразна, а, следовательно, так же многообразны и их специфические потребности в питательных веществах, для культивирования микроорганизмов предложены тысячи различных по составу питательных сред. Качественный диапазон этих сред весьма широк –– от растворов минеральных солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных, приготовляемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой и используемых для выделения и культивирования особо требовательных микроорганизмов, например, патогенных, типа стрептококков, легионелл, микоплазм и др.

Для того, чтобы ориентироваться в таком многообразии питательных сред их издавна классифицируют с различных позиций: по физическому состоянию, составу, по назначению –– для культивирования, изоляции, идентификации, хранения определенных видов микроорганизмов и др.

Многие из сред стали «классическими», их преимущества были подтверждены в результате длительного и широкого использования в различных областях микробиологии. К ним, например, относятся среды МакКонки и Плоскирев, сочетающие селективные и дифференциальнодиагностические свойства при исследовании содержимого кишечника; среда Китт-Тароцци для анаэробов, в первую очередь патогенных клостридий, среда Блаурокка для бифидобактерий, среды Чапека и Сабуро для культивирования дрожжеподобных и мицелиальных грибов.

Не взирая на существующее множество сред и в настоящее время проводятся исследования по их оптимизации и созданию новых на базе современных представлений о метаболизме отдельных видов микроорганизмов. Универсальных сред, одинаково пригодных для всех микроорганизмов, не существует.

Качественно-количественный состав питательных сред часто подбирается эмпирически, без обоснования использования тех или иных компонентов, однако в настоящее время эта проблема решается, главным образом, на основе современного уровня знаний микробного метаболизма.

Элементы, которые в первую очередь необходимы для роста микроорганизмов и должны включаться в состав питательной среды, определены из химического состава микробных клеток, который, в принципе, одинаков у всех живых организмов.

Основная часть общей массы клеток представлена водой (80 – 90%) и только 10 – 20% приходится на сухое вещество. По количественному содержанию в сухом веществе выделяют макро- и микроэлементы. К числу первых относятся: углерод, кислород, азот, водород, сера, фосфор, калий, натрий, магний, кальций, железо. К микроэлементам –– марганец, молибден, цинк, медь, кобальт и др., большинство из которых необходимо в следовых количествах. По этой причине в состав многих сред микроэлементы не добавляют, так как потребность в них может

6

быть удовлетворена за счет примесей в солях макроэлементов. Кроме того, не все микроорганизмы нуждаются в микроэлементах.

И если потребность микроорганизмов в минеральных элементах определить сравнительно просто, тем более что она во многом сходна у большинства организмов, потребность в углероде и азоте –– важнейших биогенных элементах, определить значительно сложнее. Это обусловлено тем, что микробный метаболизм, как конструктивный (биосинтетический), так и энергетический отличается чрезвычайным разнообразием, которое, в свою очередь, является результатом способности микроорганизмов использовать в качестве источника углерода и энергии широкий набор органических и неорганических соединений. В основе метаболического разнообразия лежат

иразные биохимические пути метаболизирования исходных субстратов, т. е. один и тот же субстрат в зависимости от условий может метаболизироваться различными путями.

Вотличие от животных и растительных организмов, микроорганизмы характеризуются разнообразием и типов питания, которые выделяют по трем основным критериям –– источник углерода, источник энергии и донор электронов (водорода).

Взависимости от природы источника углерода все микроорганизмы разделены на 2 большие группы –– автотрофы, использующие углекислоту, и гетеротрофы, требующие для роста

иразмножения готовых органических веществ. С учетом разнообразия источников энергии и доноров электронов эти группы подразделены на подгруппы, в результате чего у микроорганизмов выделены 8 типов питания. Каждый тип питания характерен для определенных микроорганизмов

иотражает их физиолого-биохимические свойства.

Большинство микроорганизмов, в том числе и патогенных, имеют тип питания, при котором источником углерода, энергии и донорами электронов являются органические вещества.

Потребности микроорганизмов в органических источниках углерода весьма разнообразны. Некоторые виды являются «всеядными» и могут потреблять различные по химической природе вещества, другие отличаются большей избирательностью и используют лишь некоторые из них.

Специфичность набора органических соединений, свойственного каждому виду микроорганизмов, учитывается при создании элективных и дифференциально-диагностических сред, широко применяемых в санитарной и клинической микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

При выборе углеродсодержащего субстрата необходимо учитывать, что усвояемость органических веществ в значительной степени зависит и от их свойств –– растворимости, степени окисленности атомов углерода, пространственной конфигурации и полимеризации их молекул. Обычно микроорганизмы усваивают определенные оптические изомеры –– сахара, относящиеся к D-ряду, аминокислоты –– к L-ряду. Очень мало микроорганизмов обладают ферментами, под действием которых один оптический изомер превращается в другой.

Использовать такие биополимеры как крахмал, полисахариды, белки, жиры могут только те микроорганизмы, у которых синтезируются определенные гидролитические ферменты –– амилазы, протеазы, липазы в форме экзоферментов, т.е. ферментов, выделяемых клеткой в среду обитания.

Процесс потребления полимеров начинается с их ферментативного гидролиза до более низкомолекулярных водорастворимых продуктов, которые легко попадают в клетку и подвергаются биохимическим превращениям в конструктивном и энергетическом метаболизмах.

Для подавляющего большинства гетеротрофных микроорганизмов основными, легко доступными источниками углерода и энергии являются углеводы, аминокислоты, белки, органические кислоты.

Характеризуя потребность микроорганизмов в органических источниках углерода следует отметить, что наибольшая степень гетеротрофности присуща патогенным микроорганизмам, приспособившимся к жизни в организме человека и животных. Состав питательных сред для их культивирования особенно сложен. Они содержат белки или продукты их неглубокого гидролиза (пептиды), витамины, фрагменты нуклеиновых кислот и др. Для приготовления таких сред используют различного типа гидролизаты и экстракты мяса, кровь или сыворотку, дрожжевые и растительные экстракты и многое другое.

Эти среды пригодны для культивирования самых разных видов и особенно удобны в тех случаях, когда неизвестна потребность микроба в факторах роста или он нуждается во многих факторах роста одновременно. Недостатком таких сред является сложность или невозможность достижения их стандартности из-за нестандартности и ограниченной контролируемости состава и свойств исходного сырья.

7

Многие гетеротрофные микроорганизмы нуждаются не только в органическом, но и в неорганическом источнике углерода –– углекислоте. Так как микроорганизмы, использующие органический субстрат, образуют углекислоту в значительных количествах, потребность в ней для биосинтеза может быть удовлетворена и за счет этого источника. Тем не менее, удаление углекислоты из среды часто задерживает, а иногда и полностью подавляет рост микроорганизмов. Для некоторых бактерий и грибов требуются относительно высокие концентрации углекислоты в атмосфере (5 – 10%).

Микробный метаболизм

Органическое вещество, поглощенное клеткой, вовлекается в метаболические процессы. Клеточный метаболизм микроорганизмов складывается из двух потоков биохимических

реакций, имеющих разную направленность и составляющих соответственно суть энергетического (катаболизма) и конструктивного (анаболизма) метаболизмов.

Вреакциях энергетического метаболизма, в результате окисления органического субстрата, образуется энергия, которая запасается в клетках в форме АТФ, и используется в процессах биосинтеза и для осуществления других жизненных функций.

Вреакциях конструктивного метаболизма происходит синтез макромолекул, составляющих основную массу клетки, из более простых соединений внеклеточной среды или образующихся в клетке в процессах катаболизма.

Реакции катаболизма и анаболизма тесно взаимосвязаны и представляют собой две стороны единого метаболизма, которые можно разделять с большой долей условности. В силу этого органическое вещество в составе питательной среды, как правило, выполняет двоякую функцию, являясь одновременно и источником углерода и источником энергии.

Однако нередко для конструктивного обмена могут использоваться одни вещества, а для энергетического другие. Так, уксуснокислые бактерии получают энергию путем окисления этанола, но не могут его использовать для синтеза клеточных компонентов; гомоферментативные молочнокислые бактерии энергию получают при сбраживании сахаров, а для конструктивных процессов им необходимы готовые аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, которые они не могут синтезировать сами.

Конструктивный метаболизм микроорганизмов в целом направлен на синтез четырех

основных типов биополимеров –– белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Для биосинтеза белков и нуклеиновых кислот важнейшим элементом, кроме углерода, является азот.

Самым доступным источником азота для большинства микроорганизмов являются ионы аммония, которые они могут получать из солей органических и неорганических кислот, аминокислот, белков и других азотсодержащих веществ. Для многочисленной группы бактерий, главным образом патогенных, в качестве источников азота необходимы азотсодержащие органические вещества.

Если таким источником азота являются аминокислоты, микроорганизмы могут их использовать непосредственно для синтеза белков, либо предварительно осуществить их дезаминирование, а выделившиеся при этом аминогруппы использовать для синтеза собственных аминокислот, белков.

Однако, для роста некоторых микроорганизмов необходимы определенные аминокислоты, которые они не могут синтезировать сами. К числу микроорганизмов, нуждающихся в таких «незаменимых» аминокислотах, относятся золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк, молочнокислые бактерии и некоторые другие. В зависимости от физиологических особенностей микробов, количество «незаменимых» аминокислот различно –– для золотистого стафилококка обязательно наличие в питательной среде лишь триптофана и цистина, а для гемолитического стрептококка –– 17 аминокислот.

Белки, как источники азота, доступны только тем микроорганизмам, которые образуют протеолитические ферменты, выделяемые в среду (т.е. в экзоформе). Под действием этих ферментов белки расщепляются до более низкомолекулярных веществ –– пептонов и аминокислот.

Биохимические реакции, в ходе которых синтезируются белки и нуклеиновые кислоты в принципе сходны у микроорганизмов различных систематических групп.

Значительные различия наблюдаются, главным образом, в биохимических путях синтеза полисахаридов и липидов, в силу чего химический состав и структура этих соединений часто характерны для определенных таксономических групп.

8

Источники всех других элементов, необходимых для конструктивного метаболизма (фосфора, серы, водорода, калия, натрия и др.) являются практически общими для всех микроорганизмов и представлены солями неорганических кислот, водой.

Энергетический метаболизм микроорганизмов, как и конструктивный, характеризуется разнообразием биохимических механизмов. В этом метаболизме различают три основных типа –– аэробное дыхание, анаэробное дыхание и брожение, наиболее распространенным из которых является аэробное дыхание. В этом процессе органическое вещество окисляется до углекислоты и воды с максимальным выделением энергии, заключенной в этом веществе. Многие микроорганизмы с аэробным дыханием –– строгие аэробы, однако некоторые из них относятся к факультативным аэробам, поскольку они могут образовывать АТФ и в анаэробных условиях –– путем брожения.

Некоторые микроорганизмы, главным образом бактерии, получают энергию в анаэробном дыхании, т.е. в результате окисления веществ, где в качестве акцепторов электронов выступает не кислород, а неорганические соединения. Так, отдельные виды рода Bacillus, E. coli осуществляют анаэробное дыхание, в процессе которого нитрат (NO3) восстанавливается до аммиака; Clostridium aceticum окисляет молекулярный водород, используя в качестве акцептора электронов углекислоту.

Круг органических соединений, которые могут подвергаться окислению, очень широк, необходимо только, чтобы степень их окисленности была бы меньше, чем у углекислоты.

Простейшим по метаболизму типом энергетического метаболизма является брожение. Процессы брожения протекают в анаэробных условиях и сопровождаются выделением энергии. Основным субстратом брожения являются углеводы, однако бактерии могут сбраживать органические кислоты, в том числе и аминокислоты, а также пурины и пиримидины.

Известно много типов брожения, каждый из которых вызывается особой группой микроорганизмов и в соответствии с механизмом сопровождается образованием специфических конечных продуктов. Конечными продуктами брожений обычно являются различные органические кислоты –– молочная, уксусная, янтарная, лимонная и др., а также спирты (этиловый, бутиловый, пропиловый), углекислый газ и водород. По выходу основного конечного продукта выделяют и соответствующие типы брожения.

В силу того, что при брожении не происходит полного окисления субстрата и в среду выделяются частично окисленные вещества, еще содержащие энергию –– органические кислоты, спирты и др., общий выход АТФ в этом процессе на 1 моль сбраживаемого субстрата значительно (~ в 30 раз) ниже, чем при метаболизме того же субстрата в процессах дыхания.

Основная часть энергии, получаемая в любом энергетическом метаболизме, расходуется в процессах биосинтеза клеточных компонентов.

Таким образом, из краткой информации, представленной выше, о пищевых потребностях микроорганизмов, особенностях и многообразии их конструктивного и энергетического метаболизмов следует, что выбор или разработка новых питательных сред для культивирования микроорганизмов должны основываться на точном знании физиологии каждого конкретного вида.

Тем не менее, для всех сред, не взирая на их разнообразие и многочисленность, выделяются общие основные требования, которые необходимо учитывать при разработке и приготовлении питательных сред. К их числу относятся следующие требования:

∙Среды должны содержать все необходимые источники питания в оптимальных для данного микроорганизма концентрациях –– недостаток или избыток питательных элементов оказывает негативное действие; в некоторых случаях среды должны содержать специальные факторы роста.

∙В составе среды все источники питания должны быть представлены в такой форме, в которой микроорганизмы способны их усваивать.

∙Основные компоненты среды (источники углерода, азота, фосфора, серы, калия) должны содержаться в соотношениях, приблизительно соответствующих соотношениям их в клетках.

∙Среды, в зависимости от вида культивируемого микроорганизма, должны иметь определенный уровень кислотности –– рН, при котором наиболее активно протекают процессы его жизнедеятельности. Повышенной чувствительностью к рН среды отличается большинство патогенных микроорганизмов, активный рост которых наблюдается в сравнительно узком диапазоне значений этого фактора –– 7,0 – 7,4.

9

∙Среды должны иметь определенный уровень окислительно-восстановительного потенциала (Еh), который зависит от состава питательной среды, степени насыщения ее кислородом, а также от уровня рН –– чем ниже рН, тем выше Eh и наоборот. Как и в случае с рН, пригодность среды для тех или иных микроорганизмов, независимо от ее состава, может определяться уровнем и этого фактора –– Eh.

∙Среды должны быть изотоничными для микробных клеток, то есть осмотическое давление в среде должно быть практически таким же, как внутриклеточное.

∙Среды должны быть стерильными.

Кроме вышеуказанных требований, являющихся общими, практически для всех сред, имеются и многие другие, касающиеся, например, тех свойств среды, которые могут затруднить или сделать некорректными визуальный контроль за процессами жизнедеятельности микроорганизмов (это цветность, прозрачность, консистенция и др.).

Следует отметить, что иногда рост микроорганизмов отсутствует при посеве их на питательную среду, считающуюся удовлетворительной, например, на питательный бульон. Причины этого явления в основном остаются неизвестными, идентифицированы только некоторые ингибиторы, к которым относятся жирные кислоты и перекиси.

Жирные кислоты содержатся почти во всех материалах, используемых в микробиологии - в пептоне, агаре, казеине, вате и др. В составе питательных сред они подавляют или ограничивают рост многих видов микроорганизмов, в том числе патогенных, например, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhосае и др. Для удаления жирных кислот в среду добавляют какое-либо вещество, связывающее жирные кислоты –– 0,5% активированного угля или 0,15% растворимого крахмала, или 10% (объемных) сыворотки.

Перекиси обнаруживаются в средах, подвергнутых ультрафиолетовому облучению или находящихся на свету, а в некоторых средах после автоклавирования.

Содержание перекисей в питательных средах варьирует, вследствие чего в одних случаях наблюдается ингибирование только штаммов, не содержащих каталазу, тогда как в других не растут даже штаммы, продуцирующие ее.

Ингибиторы роста микроорганизмов могут образовываться под действием различных, часто неизвестных факторов в процессе приготовления и нагревания сред. Значительным ингибирующим эффектом обладают глюкозофосфаты, образующиеся в процессе нагревания среды; комплекс, содержащий медь и пептон и др.

ГЛАВА 2. КЛАССИФИКАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Для того, чтобы ориентироваться в большом многообразии питательных сред как по составу, так и по назначению было предложено несколько их классификаций.

По составу питательные среды для культивирования микроорганизмов делятся на две группы –– натуральные и синтетические. Для практических исследований широко используют натуральные (естественные) среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца, желчь, сыворотка крови, а также отвары и экстракты, полученные из различных природных субстратов –– мяса, различных частей растений, почвы. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в таких средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют сложный непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения физиологии, обмена веществ микроорганизмов, так как в значительной степени не позволяют учесть потребление компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития. Натуральные среды используются, главным образом, для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами натуральных сред неопределенного состава, которые широко применяются в лабораторной практике, служат мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, картофельные среды и мн.др.

К числу натуральных сред неопределенного состава относят и так называемые полусинтетические среды, в состав которых, наряду с соединениями известной химической

10

природы, входят вещества неопределенного состава. К полусинтетическим средам относятся, например, мясо-пептонный бульон с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро и т.п.

К полусинтетическим средам следует относить также среды, которые содержат соединения известного состава –– углеводы, нитраты, фосфаты и другие и, в незначительных количествах, соединения неопределенного состава –– гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт, добавляемые в качестве факторов роста.

Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в точно указанных концентрациях, т.е. состав их полностью известен. Достоинством таких сред являются стандартность и воспроизводимость с высокой степенью точности. Эти среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов.

Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена веществ. Существует большое количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам неопределенного состава. Однако только для немногих патогенных бактерий имеются синтетические среды. Их применяют, главным образом, для экспериментального изучения метаболизма микроорганизмов, реже для аналитических целей, диагностики и хранения культур.

По назначению различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специальные питательные среды.

Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и могут применяться в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера, сусло жидкое, сусло-агар и др.

Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изучения их свойств и хранения. Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические (индикаторные), консервирующие.

Элективные среды применяются, главным образом, для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для поучения накопительных культур. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов. Избирательность питательной среды для определенных видов микроорганизмов достигается путем создания оптимальных для них условий (рН, Eh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией, или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, азид натрия, теллурит калия, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. Сопутствующие микроорганизмы или совсем не растут на таких средах, или развитие их в значительной степени задерживается.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения биохимических свойств и дифференцировки одного вида (рода) микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида. Диффенцирующие свойства питательной среды создаются внесением субстрата, к которому определяется отношение микроорганизма (например, сахаров, аминокислот и др.), соответствующих индикаторов (например, рНиндикаторов – бромтимолблау, фуксин и др.; Eh-индикаторов).

Консервирующие (транспортные) среды используются широко в клинической практике для сохранения жизнеспособности микроорганизмов в период от момента взятия биоматериала до посева. Основная цель их использования –– сохранить жизнеспособность возбудителя и предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры в период транспортировки образцов.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие и

сухие.

Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, реже –– для накопления биомассы (например, анаэробов).

Плотные среды используют для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, определения их антагонистических свойств и в ряде других случаев.