24

В настоящее время известно много способов их стерилизации, которые разделяют на две основные группы: термическую и холодную стерилизацию.

Из термических способов наиболее широко используются стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), стерилизация текучим паром, тиндализация и кипячение.

Стерилизация насыщенным паром под давлением –– один из наиболее эффективных методов, основанный на прогревании субстрата насыщенным паром в автоклавах –– аппаратах, работающих под давлением выше атмосферного, так как с повышением давления пара повышается и его температура (табл.3).

Таблица 3

Температура насыщенного пара при различных давлениях

Избыточное давление, атм	Температура, оС
0,5	112
0,6	114
0,7	116
0,8	117
1,0	121
1,5	127
2,0	134

Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает надежность стерилизации: при автоклавировании погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Среды, предназначенные для стерилизации в автоклаве, наливают не выше половины высоты сосуда, сосуд закрывают ватно-марлевой пробкой или резиновой пробкой, которую завальцовывают.

Температура и длительность автоклавирования определяются прежде всего составом питательной среды. Обычно стерилизация проводится при температуре 121оС в течение 15 минут. Тем не менее необходимо помнить, что такая стерилизация не всегда является безвредной для питательной среды: длительное автоклавирование при повышенном давлении часто приводит к гидролизу в ее составе некоторых питательных компонентов.

Питательные среды, в составе которых имеются термолабильные вещества, стерилизуют при более низких температурах и давлении –– 112оС (т.е. 0,5 атм) в течение 15 мин. При таком режиме стерилизуют, например, среды, содержащие углеводы, пивное сусло, некоторые витамины, молоко, желатин.

При выборе режима стерилизации необходимо учитывать не только состав среды, но и уровень ее кислотности или щелочности –– рН. В случае кислой реакции или повышенной щелочности могут подвергаться гидролизу полимерные компоненты среды. Так, при стерилизации в автоклаве среды, содержащей желатин, при рН ниже 6,0 происходит пептонизация желатина, в результате чего среда не затвердевает даже при охлаждении. При рН ниже 5,0 частично гидролизуется и агар-агар, утрачивая свойство образовывать плотный гель. В процессе стерилизации среды, имеющей щелочную реакцию, карамелизуются углеводы, выпадают в осадок соли некоторых металлов.

Чтобы избежать подобных явлений, желательно стерилизовать среды при нейтральном значении рН, а после автоклавирования подкислить или подщелочить их с помощью стерильных растворов кислот или щелочей соответственно. Кроме того, некоторые компоненты среды стерилизуют при таком значении рН и таком режиме, при которых они практически не изменяются, а затем их добавляют стерильно в среды в нужном количестве.

На всех этапах процесса стерилизации необходимо вести контроль за режимом по таким критериям, как давление и температура. Для наблюдения за давлением в автоклаве пользуются манометрами, которые периодически проходят поверку.

Для контроля за температурой пользуются химическими термотестами, которые представляют собой вещества, изменяющие свой цвет и(или) физическое состояние после воздействия определенной температуры. Запаянные ампулы с порошком, смешанным с краской,

25

или вещества, плавящиеся только при определенной температуре, помещают в стерилизационную камеру вместе с питательными средами, подлежащими стерилизации. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленной краски, или плавящиеся вещества приобретают иное состояние –– из кристаллического, переходят в аморфное со спонтанным изменением окраски, или только плавятся (табл.4).

		Таблица 4
Наименование	Температурный параметр,	Цвет расплавленного
	подлежащий контролю, оС	индикаторного вещества
Резорцин, фуксин кислый	110 + 2	Фиолетовый
		или темно-красный
Бензойная кислота,	120 + 2	Фиолетовый
Фуксин кислый		или темно-красный
Бензамид, фуксин кислый	124 + 3	Фиолетовый
Сукцинамид, фуксин кислый	124 + 2	Фиолетовый
		или темно-вишневый
Никотинамид, фуксин кислый	132 + 2	Фиолетовый
		или темно-вишневый
Мочевина, фуксин кислый	132 + 2	Фиолетовый
		или темно-вишневый
Левомицетин, фуксин кислый	160 + 2	Темно-красный
	– 10	или фиолетовый
Лактоза, фуксин кислый	170 + 3	Темно-коричневый
		или темно-фиолетовый
Тиомочевина	180 + 2	Желтый или желто-зеленый
	– 10
Гидрохинон	180 + 2	Серый с фиолетовым оттенком
	– 10
Кислота винная	180 + 2	Светло-коричневый
	– 10	или коричневый

Более надежным методом контроля эффективности стерилизации является применение биоиндикаторов. Для проведения такого контроля в стерилизационную камеру, одновременно со средами, подлежащими стерилизации, помещают биотесты –– пробирки с полосками марли или фильтровальной бумаги, зараженные микроорганизмами с известной устойчивостью к температурным воздействиям. Обычно для этой цели используют бактерии рода Bacillus –– B. subtilis или B.stearothermophilus. После окончания стерилизации биотесты направляют в лабораторию, где пробирку с биотестом заливают сахарным бульоном и посевы инкубируют 48 ч при 37оС. При наличии визуального роста готовят мазки для идентификации культуры.

Для контроля стерильности питательные среды после стерилизации помещают в термостат при 37оС на 5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще агаризованных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, производят химический контроль готовых сред, для чего в нескольких образцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота, хлоридов и др.

Кроме того, каждая среда должна пройти биологический контроль. Для этого несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроорганизма, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после всех видов контроля среды можно использовать по назначению.