ЗМІСТ

Вступ

Огляд літератури

1. Дитячі вірусні інфекції із повітряно-крапельним шляхом передачі

1.1 Біологія вірусів грипу, кору, червонянки, паротиту, вітряної віспи, інфекційного мононуклеозу

1.2 Епідеміологічні, клінічні та патогенетичні аспекти дитячих вірусних інфекцій із повітряно-крапельним шляхом передачі

1.3 Основні методи діагностики, профілактики та лікування

2. Вірусні кишкові інфекції у дітей

2.1 Біологія ентеро- та ротавірусів

2.2 Епідеміологія, клініка та патогенез вірусних кишкових інфекцій у дітей

2.3 Діагностика, профілактичні заходи та лікування вірусних кишкових інфекцій у дітей

Експериментальна частина

3. Матеріали та методи досліджень

4. Результати та їх обговорення

4.1 Аналіз розповсюдження вірусних інфекцій із повітряно-крапельним шляхом передачі у дітей в м. Дніпродзержинськ протягом 2010-2012 рр.

4.2 Аналіз розповсюдження кишкових інфекцій у дітей в м. Дніпродзержинськ протягом 2010-2012 рр.

5. Охорона праці та безпека у надзвичайних ситуаціях

5.1 Шкідливі та небезпечні фактори при проведенні вірусологічних досліджень

5.2 Заходи для створення безпечних умов праці

Висновки

Перелік посилань

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

3. Матеріали та методи досліджень

Наявність Аг ротавірусу у зразках фекалій визначали за допомогою імуноферментного тесту RIDASCREEN.

1. Принцип методу. В імуноферментному тесті RIDASCREEN для визначення ротавірусного Аг використовували принцип сендвіч-методу. На поверхню лунок мікропланшетів сорбували моноклональні антитіла до капсидного білку-продукту шостого вірусного гена ротавирусів, який є групоспецифічним антигеном для усіх відомих патогенних для людини ротавірусів. У лунку вносили аліквоту тестованої суспензії калу і інкубували одночасно з іншими моноклональними антитілами до ротавірусу, кон’югованими з пероксидазою хріну. В результаті інкубації утворювався сендвіч-комплекс, в якому антигени ротавірусу знаходилися між твердою фазою лунок і антитілами, кон’югованими з ферментом. Антитіла, що не зв'язалися з ферментом надалі видаляли промиванням. У лунки вносили субстрат. Якщо тест виявлявся позитивним, фермент, що зв'язався з лунками, перетворював безбарвний субстрат на забарвлений в синій колір продукт. Додавання стоп-реагента змінювало забарвлення з синього кольору на жовтий. Інтенсивність забарвлення була прямо пропорційною кількості антигена ротавірусу, присутнього в зразку.

2. Матеріали і реагенти.

Набір містив наступні реагенти: 1) Plate – мікропланшет в рамці-утримувачі, що складався з дванадцяти відокремлюваних 8-лункових стрипів, з адсорбованими мишачими моноклональними антитілами до ротавірусу. 2) Diluent 1 – буфер для розведення зразків, готовий до використання і який містив білковий забуферний розчин NaCl і 0,1% Kathon. Забарвлений у блакитний колір. 3) Wash – промивальний буфер – 10-кратний концентрат, який містив фосфатний буфер, NaCl і 0,1% мертіолат. 4) Сontrol+ – позитивний контроль , що містив інактивований ротавірус мавп (SA - 11). Готовий до використання. 5) Conjugate – кон’югат ферменту. Містив моноклональні антитіла до ротавірусу, кон’юговані з пероксидазою хріну, в стабілізуючому білковому розчині. Готовий до використання. Містив 0,1% Kathon. Забарвлений в зелений колір. 6) Substrate – розчин субстрату, який містив перекис сечовини і тетраметилбензидин (ТМБ). Готовий до використання. 7) Stop – стоп-реагент. Містив 1н сірчану кислоту

3. Устаткування та обладнання: пробірки для аналізу, трансфер-піпетки, вортекс, мікропіпетки об'ємом 50-100 мкл і на 1 мл, мірний циліндр (1000 мл), таймер, прилад для промивання планшетів або багатоканальна піпетка (300 мкл), планшетний фотометр (450 нм, при необхідності додаткова довжина хвилі порівняння ≥ 600 нм), фільтрувальний папір, контейнер для відходів.

4. Процедура дослідження

Перед використанням прогрівали усі реагенти і планшет Plate при кімнатній температурі (20-25°С). Безпосередньо перед використанням усі реагенти ретельно перемішали. Для приготування промивального буфера одну частину концентрованого промивального буфера Wash розводили дев'ятьма частинами дистильованої води. Для приготування зразків поміщали 1 мл буфера для розведення зразків Diluent 1 в промарковану пробірку. Набирали в одноразову піпетку рідкі фекалії до тих пір, поки рівень рідини не піднімався вище другого потовщення (приблизно 100 мкл), і суспендували його у буфері для розведення зразків, поміщеному в пробірку. Надалі зразок центрифугували при 5000 об/хв (приблизно 2300-2500 g) впродовж 5 хвилин. Поміщали в утримувач необхідну кількість лунок. Вносили в лунки по 2 краплі (100 мкл) позитивного контролю Control+, буфера для розведення зразків Diluent 1 (негативний контроль) чи розведених зразків. Додавали в кожну лунку по 2 краплі антитіл, кон’югованих з ферментом Conjugate. Ретельно перемішували і інкубували при кімнатній температурі протягом 60 хвилин.

Надалі до кожної лунки додавали по 2 краплі субстрату Substrate. Інкубували планшет 15 хв при кімнатній температурі в темному місці. Після інкубації реакцію зупиняли додаванням в кожну лунку по 1 краплі стоп-реагента Stop. Після акуратного перемішування вимірювали поглинання при 450 нм, використовуючи довжину хвилі порівняння ≥ 600 нм.

5. Оцінка отриманих результатів і їх інтерпретація

1. Розрахунок порогового рівня (рівня відсікання, cut - off). Рівень відсікання визначали додаванням 0,15 одиниць оптичної щільності до виміряного значення негативного контролю.

Рівень відсікання = оптична щільність негативного контролю + 0,15

2. Результати тесту. Зразки вважали позитивними, якщо оптична щільність більш ніж на 10% перевищувала рівень відсікання. Зразки, оптична щільність яких лежала в межах ±10% від рівня відсікання не могли бути достовірно віднесені до позитивних або негативних. Їх розглядали, як невизначені (чи сумнівні). У таких випадках повторювали дослідження з новим зразком. Якщо результат повторного дослідження знову виявлявся невизначеним, зразок розглядали, як негативний. Зразки вважали негативними, якщо їх оптична щільність була нижчою, ніж на 10% за рівень відсікання.