Лабораторная диагностика энтеровирусных инфекций

Лабораторная диагностика энтеровирусных инфекций проводится путем выделения вируса из организма больного, а также по нарастанию титра вирусспецифических антител. Вирусы выделяют из фекалий, крови, смывов носоглотки и другого материала в зависимости от периода заболевания одновременно на первичных и перевиваемых культурах клеток, а также путем заражения мышей-сосунков. Для идентификации вируса применяется реакция нейтрализации.

Гемагглютинирующие варианты вирусов ECHO и Коксаки можно идентифицировать с помощью РТГА, которая, подобно реакции вируснейтрализации, характеризуется типоспецифичностью.

Выделение энтеровирусов из организма бoльнoгo особенно из фекальных масс, не является абсолютным основанием для постановки диагноза, учитывая распространение бессимптомного носительства. Поэтому необходима серологическая диагностика с использованием парных сывороток, взятых в первые дни и на 2—3-й неделе после начала заболевания. В положительном случае отмечается нарастание титра антител во второй сыворотке не менее чем в 4 раза в реакциях нейтрализации, РСК, РТГА.

 

Риновирусы

Эта группа вирусов впервые была выделена в 1960 г. от людей, больных острым ринитом.

Вирионы риновирусов имеют сферическую форму и кубический тип симметрии, достигая 20—30 нм в диаметре. Они похожи на энтеровирусы, но в отличие от них теряют свои инфекционные свойства в кислой среде. Хорошо сохраняются при низких температурах.

Для культивирования риновирусов используют культуру клеток, приготовленную из фибробластов легких эмбриона человека или эпителия трахеи человека и хорьков. В оптимальных условиях культивирования проявляется ЦПД.

Выделено 113 серотипов риновирусов, многие из которых имеют идентичные антигены, ответственные за перекрестные серологические реакции. Они не обладают гемагглютинирующими свойствами.

Патогенез заболеваний человека и иммунитет. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Риновирусы локализуются в эпителиальных клетках слизистой оболочки носа, а у детей — и бронхов, вызывая насморк, бронхиты и бронхопневмонии.

После заболевания сохраняется непродолжительный иммунитет, который определяется не столько сывороточными антителами, сколько секреторными иммуноглобулинами типа IgA. Специфическая профилактика не разработана.

Лабораторная диагностика основана на выделении вируса в чувствительных культурах клеток. Для экспресс-диагностики применяется иммунофлюоресцентный метод, который позволяет обнаружить вирусный антиген в цитоплазме эпителиальных клеток слизистой оболочки.

 

Афтовирусы

К роду афтовирусов относится вирус ящура — возбудитель высококонтагиозного заболевания парнокопытных домашних животных, вирусная природа которого была установлена еще в 1898 г. Ф. Леффлером и П. Фрошем. Вирус ящура мало чем отличается от других пикорнавирусов. Существует 7 серотипов вируса яищфа, отличающихся друг от друга типоспецифическими антигенами.

Патогенез заболеваний человека. Вирус репродуцируется в средних слоях эпителия кожи и слизистых оболочек. Затем проникает в кровь, вызывая вирусемию. При этом может произойти поражение миокарда и паренхиматозных органов.

После перенесения заболевания сохраняется непродолжительный типоспецифический иммунитет (около 1 —1,5 лет).

Экология и распространение. Источником инфекции являются больные животные. Человек заражается главным образом при уходе за ними, реже — при употреблении в пищу зараженных продуктов (сырого молока и мяса) без достаточной термической обработки.

Вирус ящура в течение 2 мес сохраняется в некоторых пищевых продуктах (масле, жирах), а также в сгустках крови и костном мозге погибших животных.

Лабораторная диагностика. Исследуемый материал (содержимое везикул) вводится в кожу стопы морской свинки. Через 24—48 ч в месте введения, а также в полости рта появляются везикулы. Вирус можно выделить в культуре клеток. Серодиагностику проводят в реакции вируснейтрализации и РСК с парными сыворотками.

 

Дополнительные  материалы по лабораторной диагностике энтеровирусной инфекции

Кишечные вирусы (энтеровирусы) человека входят в род Enterovirus семейства Picornaviridae. К ним отно­сятся вирусы полиомиелита (3 серотипа), Коксаки А (24 серотипа), Коксаки В (6 серотипов), ECHO (34 серотипа) и энтеровирусы человека 69—72-го сероти­пов. Энтеровирус 70 вызывает острый геморрагический конъюнктивит, энтеровирус 72 — вирус гепатита А. В род Enterovirus входят также кишечные вирусы животных (крупного рогатого скота, обезьян, свиней, мышей) и насекомых. Энтеровирусы животных характеризуются видовой специфичностью.

 

Обратите внимание: Коксаки А 23 идентичен ЕСНО 9.  ЕСНО 28 отнесен к риновирусам, ЕСНО 34 – вариант Коксаки А 24

 

Энтеровирусы вызывают у человека поражение цент­ральной нервной системы (энцефалит, менингоэнцефалит, полиомиелит, менингит), желудка и кишок (диарея, гепатит, панкреатит), а также дыхательных путей (ри­нит, фарингит, пневмония новорожденных и др.), сердечно-сосудистой системы (миокардит, перикардит). Возможно также развитие герпетической ангины, экзан­темы, везикулярного стоматита, миалгии и конъюнкти­вита. Различные энтеровирусы могут обусловливать одинаковые клинические проявления, в то же время один энтеровирус способен привести к развитию разных кли­нических синдромов.

Материалом для исследования служат фекалии, смы­вы с носовой части глотки, спинномозговая жидкость, кровь, сыворотка, содержимое везикул, моча, асцитическая жидкость. От трупа берут на исследование кровь, спинномозговую жидкость, ткань спинного и продолго­ватого мозга, варолиева моста, кусочки кишок и их содержимое, кусочки печени, селезенки, легкого, подже­лудочной железы, миокарда, лимфатические узлы. Ма­териал берут в первые часы болезни, от трупа — не позднее чем через 3—4 ч после смерти.

Кровь (около 10 мл) для вирусологического анализа и приготовления сыворотки берут натощак в начале болезни, а затем спустя 3—4 недели.

Фекалии (4—6 г) собирают с интервалом 1—2 дня (можно использовать флаконы из-под антибиотиков). Готовят 10 % суспензию в растворе Хенкса, встряхивают и осветляют центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин (при возможности материал центрифугиру­ют при 10 000 об/мин). Надосадочную жидкость обра­батывают эфиром  (к осветленной суспензии фекалыий добавляют 50 % по объему диэтилового эфира, смесь оставляют в холодильнике под ватно-марлевой пробкой в течение 12-16 часов)  и антибиотиками.

Ректальные тампоны помещают в пробирку с 1—2 мл раствора Хенкса или Эрла, споласкивают, отжимают. Материал центрифугируют и обрабатывают эфиром и антибиотиками.

Глоточный смыв в объеме 20 мл получают при 2-кратном (с интервалом 3 мин) полоскании горла стерильным солевым раствором или дистиллированной водой. Тампонами протирают заднюю стенку глотки, миндалины и небные дужки и погружают в пробирку с 1—2 мл раствора Хенкса. Материал центрифугируют и обрабатывают эфиром и антибиотиками.

Стерильную прозрачную спинномозговую жидкость (около 3 мл) используют для выделения вируса без предварительной обработки. Мутную спинномозговую жидкость, а также содержащую эритроциты центрифу­гируют. Мочу в объеме 10 мл берут в стерильный сосуд в середине акта мочеиспускания и обрабатывают анти­биотиками.

Пробы секционного материала растирают в стериль­ной ступке, готовят 20 % суспензию в растворе Хенкса, центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин.

Материал обрабатывают  антибиотиками — пенициллином (1000 ЕД/мл) и стрептомицином (500 ЕД/мл) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем используют его для выделения вируса. Часть материала замораживают и хранят при температуре —70 °С. Мно­гократное замораживание и оттаивание недопустимо, так как приводит к инактивации вируса.

Экспресс-диагностика не нашла широкого примене­ния при энтеровирусных инфекциях из-за особенностей их патогенеза. Описано применение РИФ для исследова­ния клеток спинномозговой жидкости. При ротавирусных инфекциях применяют ЭМ и ИЭМ (см. с. 243).

Выделение вируса проводят в культурах клеток и на однодневных белых мышах (табл.).

 

Таблица. Методы выделения и идентификации энтеровирусов

 

Вид исследова­ния	Цель исследо­вания	Материал	Живая система для заражения	Культивируемый энтеровирус	Способ идентификации
Вирусологическое	Выделение и идентификация вируса	Клинический    материал: фекалии (ректальные тампоны),  смывы  с носовой части  глотки  (тампоны), спинно-мозговая        жидкость,   кровь,   содержимое везикул, моча, асцитическая жидкость	Первичные   культуры клеток почек обезьян, фибробластов эмбриона  человека,  переви- ваемые культуры клеток Vero, Hela, Hep-2, KB и др.	Полиовирусы   1-        3-го типов, Коксаки В 1-6-го   типов,    вирусы ECHO, Коксаки А (непостоянно)	РН  со   смесями поливалентных сывороток   в культурах  клеток и на мышах-сосунках;     типовая   принадлеж-ность вируса в РН с моновалентной  сывороткой; РПГ, РИФ, РСК
		Секционный материал: кровь,      спинномоз-говая жидкость, кусочки спинного,        продолговатого мозга,  варолиева  моста, кусочки     и  содержимое кишок	Культура клеток	Вирусы  Коксаки А и другие энтеровирусы	РПГ с эритроцитами человека 0 (I) группы крови, некоторые типы  энтеровирусов   (непостоянно)
		При  подозрении  на   инфекции, вызванные ECHO и Коксаки — кусочки внутренних органов,  печени, селезенки, легкого, миокарда, лимфати-ческие узлы	Однодневные    мыши-сосунки	Вирусы        Коксаки групп А и В	Данные патоморфологического исследования

 

Полиовирусы (1—3-й), большинство вирусов Коксаки В, ECHO, некоторые типы вирусов Коксаки А (7-й, 9-й, 14-й, 16-й, 21-й) при размножении в культуре клеток по­чек обезьян оказывают ЦПД. В культуре клеток почек эмбриона человека, амниона человека, диплоидных клет­ках WI-38 репродуцируются вирусы Коксаки А (11-й, 13-й, 15-й, 18-й, 20-й, 21-й, 24-й), ECHO (21-й, 34-й). Боль­шинство серотипов Коксаки А размножаются и вызыва­ют ЦПД в культуре клеток RD (культура из рабдомиосаркомы человека). Для выделения вирусов Коксаки параллельно с культурами клеток заражают новорож­денных мышей.

Вирусы Коксаки А из материала от больных наиболее успешно удается выделить только на однодневных мы­шах-сосунках, так как они не размножаются в большин­стве культур клеток обезьян и человека.

Мышей-сосунков заражают в мозг (0,01 мл), под­кожно (0,03 мл), внутрибрюшинно (0,05 мл) или ком­бинированным методом,. За инокулированными живот­ными наблюдают 14 дней. При развитии клинических симптомов из мозга больных животных и тушек готовят 20 % суспензию для дальнейшего пассирования вируса. Берут также кусочки тканей для гистологического иссле­дования.

Индикацию энтеровирусов проводят по ЦПД и бляшкообразованию под агаровым или бентонитовым  покрытиями, в культуре клеток, развитию пара­личей у мышей-сосунков и их гибели, а также по физи­ко-химическим свойствам: небольшие размеры, резистент-ность к жирорастворителям и низким значениям рН (3,0), термостабильность при температуре 50 °С в при­сутствии 1 М MgCl₂ (магния хлорида).

Для идентификации энтеровирусов применяют РН, РТГА, РСК, РПГ, РИФ с типоспецифическими иммун­ными сыворотками.

РН проводят в культуре клеток или на мышах-сосун­ках по общепринятой методике.

Идентификацию штаммов вирусов Коксаки А. В и ECHO, обладающих гемагглютинирующими свойствами, осуществляют с помощью РТГА с использованием анти­генов из зараженных клеточных культур и 1 % взвеси эритроцитов человека группы 0(І).

Для РСК вместо антисывороток применяют иммун­ную асцитическую жидкость мышей, обладающую мень­шей антикомплементарностью.

РПГ дает хорошие результаты с антигеном, концент­рированным в 200—400 раз.

Для концентрации энтеровирусов применяется бентонитовый ме­тод. К 500 мл культуральной вируссодержащей жидкости добав­ляют 0,05—0,1 % геля бентонита по сухому весу сорбента, рН сме­си доводят до 3,5—4,0 0,1 N раствором НС1. Смесь встряхивают 3—5 мин, центрифугируют при 2000—3000 об/мин в течение 10— 15 мин. Осадок (вирус-бентонит) отмывают 20—40 мл дистиллиро­ванной воды. Элюцию вируса осуществляют 0,05 М раствором трис-буфера (рН 9,0) при интенсивном встряхивании в течение 4— 5 мин. После этого смесь центрифугируют и исследуют надосадочную жидкость, в которой находится вирус. Этот метод позволяет сконцентрировать вирус в 100—200 раз.

Для серологической диагностики применяют РН, РСК, РТГА. Диагностическое значение имеет 4-кратное и более увеличение титра антител. Результаты сероло­гического исследования необходимо сопоставить с виру­сологическими, эпидемиологическими и клиническими данными.

Для проведения РН смешивают 100 доз вируса с 2-кратными разведенными сыворотками больного. При проведении РН в культурах клеток результаты учиты­вают на 3—4-й и 7—8-й день, на мышах-сосунках — на 10—14-й день.

РСК используют для диагностики полиомиелита. Диагностическое значение имеет выявление антител в титре 1 : 32 и выше, а также увеличение титра антител в 4 раза и более. Лучшие результаты дают непрогретые (малореактивные) антигены, полученные путем одно­кратного замораживания и оттаивания инфицированных клеток после наступления полной специфической дест­рукции.

РТГА для серологической диагностики энтеровирусных инфекций применяется редко. Гемагглютинирующий антиген получают при высоком титре вируса (10⁶— 10⁷ ЦПД₅₀/МЛ). Сыворотки больных обрабатывают для удаления спонтанных гемагглютининов и неспецифиче­ских ингибиторов гемагглютинации.