Острые респираторные вирусные инфекции

Острая респираторная вирусная инфекция (ОРВИ) характеризуется катаральными явлениями различной интенсивности в результате повреждения эпителия слизистой оболочки верхних дыхательных путей, поли­морфизмом клинических проявлений от легких и стер­тых форм заболевания до очень тяжелых с летальным исходом.

Вирусы, вызывающие ОРВИ, многочисленны (более 150), относятся к разным таксономическим группам. Наиболее часто вызывают ОРВИ парамиксовирусы, реовирусы, коронавирусы, риновирусы, энтеровирусы, аде­новирусы.

В основе лабораторной диагностики ОРВИ лежат экспресс-методы, вирусологическое и серологическое ис­следования.

При заболеваниях, вызванных парамиксовирусами, респираторно-синцитиальным, корона-, рео- и аденовиру­сами, для диагностики используют смывы с носовой части глотки и отделяемое слизистой оболочки задней стенки глотки, которое снимают несколькими ватными тампо­нами. Из одного тампона делают мазки-отпечатки, а ос­тальные погружают в 2—5 мл раствора Хенкса. Для повышения устойчивости парамиксовирусов к раствору добавляют 0,5 % желатина или бычьего альбумина.

Адено-, энтеро- и реовирусы можно выделить из кро­ви, мочи, фекалий, трупного материала, энтеровирусы — из спинномозговой жидкости.

Пробы следует брать как можно раньше после на­чала заболевания. Для осветления их центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Сопутствующую бак­териальную флору подавляют пенициллином и стрепто­мицином (200—250 ЕД/мл).

Хранение материала осуществляют путем заморажи­вания при температуре— 30—70°С.

Экспресс-диагностика заключается в обнаружении вирусного антигена в клетках исследуемого материала с помощью РИФ, РЭМА, РОНГА и др. Реовирусы экспресс-методами выявить не удается.

Для выделения вирусов используют культуры тканей почек обезьяны и эмбриона человека (парамиксо-, рео-и аденовирусы), культуры Нер-2, KB, HeLa(респираторно-синциатиальный вирус), органные культуры тра­хеи и легкого человеческих эмбрионов (коронавирусы). Наличие вируса определяют по его цитопатическому действию, которое выражается в образовании синцития       (парамиксо-, респираторно-синцитиальный вирусы), пре­кращении и ослаблении мерцательных движений эпите­лиальных клеток в органных культурах трахеи (коронавирус), появлении зернистости и цитоплазматических включений (рео-, аденовирусы).

Выделенные вирусы идентифицируют специфически­ми иммунными сыворотками с помощью РН в культуре ткани (парамиксовирусы, респираторно-синцитиальный, корона-, рео-, аденовирусы), РТГадс (парамиксо-, реови­русы), РТГА (парамиксо-, рео-, аденовирусы), РЭМА (парамиксовирусы), РСК (все перечисленные вирусы), РИФ (респираторно-синцитиальный, реовирусы), а так­же путем внутримозгового заражения мышей-сосунков (коронавирусы).

Серологическое исследование позволяет поставить диагноз при обнаружении специфических антител в сы­воротке больных. Для серологических реакций исполь­зуют парные сыворотки, которые берут в первые дни от начала заболевания и спустя 1—2—3 недели, но изу­чают одновременно. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более, выявленное при постановке РТГА, РН, РСК, РГГадс, РИФ, РИА, РЭМА с антигенами (диагностикумами), приготовленны­ми из  эталонных   штаммов   соответствующих  вирусов.

 

Серологические реакции в вирусологии.

Гемагглютинация - это феномен склеивания эритроцитов под воздействием вирусов. Некоторые вирусы имеют на своей оболочке рецепторы, комплементарні рецепторам поверхности эритроцитов определенных животных, и при добавлении к суспензии вирусов эритроцитов, последние склеиваются. Однако эта реакция не иммунологическая, потому что в ней не принимает участия основная система – антиген и антитело.

 

Рис. Схема реакции гемагглютинации

Рис. Реакция гемагглютинации

 

 

Рис. Реакция гемадсорбции

Реакция торможения гемагглютинации (РГГА) принадлежит к серологическим реакциям иммунитета. В РГГА специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), лишают его свойства склеивать эритроциты. (рис.)

 

 

Рис. Реакция торможения гемагглютинации

 

Реакция нейтрализации вирусов.   В основе реакции лежит  способность специфических антител крепко связываться с вирусом,  в итоге вирус не может адсорбироваться на чувствительных клетках и размножаться у них.

Для постановки реакции необходимое наличие вируса, сыворотки, которая содержит антитела, и биологического объекта, который выступает индикатором нейтрализации. Такими объектами могут быть в зависимости от вида вируса лабораторные животные, куриные эмбрионы, тканевые культуры.

 

 Иммуноферментный метод (ИФА). В иммуноферметных методах антиген взаимодействует с антителом, при этом один из реагентов связан с энзимом. Для выявления этой ензимной метки необходимый соответствующий субстрат (хромоген), который реагирует в месте соединения антигена с антителом с мобилизованным ферментом, изменяя окраску реагирующей смеси.(рис. 26, 27.).

Для такой метки широко используется фермент – пероксидаза хрена, которая в зависимости от субстрату дает разноцветные продукты реакции.

Различают прямые и непрямые иммуноферментные методы.

Прямой метод. На первом этапе реакции антиген реагирует с антителом, меченым пероксидазой, потом к образованному комплексу добавляют соответствующий субстрат (например, Н₂О₂ и 5-аминосалицилову кислоту). 

Непрямой метод. Сначала антиген  реагирует с антителами, образовывая комплекс антиген – антитело, после промывания в систему вносят противоглобулиновые антитела, меченые пероксидазой, которые связываются с первым комплексом. После следующего промывания  вносят субстрат, который, разлагаясь адсорбируемым энзимом, предопределяет появление соответствующей окраски.

 

 

Связывание меченого энзимом анти-иммуно-глобулина

Рис. Иммуноферментный метод (ИФА).

 

Рис. Иммуноферментный метод (ИФА).

 

Иммуноблотинг. Для проведения иммуноблотинга исследуемые антигены сначала разделяют с помощью элетрофореза в геле. Полученные фракции электрофоретически переносят на листок нитроцеллюлозы (блот), который находится в специальной камере. Фиксированные блоты обрабатывают специфическими к антигену антителами, отмывают и добавляют радиоактивно меченный коньюгат для выявления антител, которые связались с антигеном.

После повторного промывания листок нитроцеллюлозы размещают в кассете с рентгеновской пленкой для радиоаутографии. На проявленной пленке появятся полосы локализации антигена, который связал меченые антитела.

Вместо радиоактивной метки можно использовать люминесцентные антитела или антитела, коньюгированные с ферментом. В последнем случае субстрат для энзима (хромоген) должен быть предварительно нанесенный на нитроцеллюлозную мембрану.

Рис. Иммуноблотинг (схема и результат постановки)