Уреаза (от греч. ούρον — моча и "-аза" - стандартный аффикс биохимической номенклатуры, указывающий на принадлежность вещества к классу ферментов) — гидролитический фермент из группы амидаз, обладающий специфическим свойством катализировать гидролиз мочевины до диоксида углерода и аммиака:

Уреаза обнаружена в бактериях (например, у уробактерий), дрожжах, растениях (особенно много её содержится в семенах сои), а также у ряда беспозвоночных; в клетках животных, у которых в качестве основного продукта азотистого обмена образуется мочевина, уреаза отсутствует. В организме человека и животных уреаза образуется бактериальной флорой. В 1926 году американский биохимик Джеймс Самнер доказал, что уреаза это белок.

Обнаружение аммиака. Способность микроорганизмов образовывать аммиак можно выявить прикрепив узкую стерильную полоску лакмусовой бумаги так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой /При образовании аммиака красный лакмус синеет.

Если используют пелтонную воду, то образование аммиака выявляют с помощью реактива Несслера. На фарфоровую пластинку помещают несколько капель культу-ральной жидкости и добавляют к ним каплю реактива Несслера. В присутствии следов аммиака жидкость окрашивается в желтый цвет, при большом количестве аммиака образуется коричневый осадок.

Денитрификаторы. Для обнаружения денитрифицирующих организмов в почве используют метод накопительной культуры. Опыт проводят на среде Гильтая.

Цвет среды готовой зеленый. Среду засевают комочками почвы. Инкубация продолжается 5-7 дней в термостате при 25-30°. Об идущем процессе восстановления нитратов и образовании азота свидетельствуют посинение среды, появление пузырьков газа и пены на поверхности среды. Среда в пробирках мутнеет от развивающихся в ней бактерии.

В наибольшей степени способность к денитрификации распространена у бактерий из родов Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter, и Micrococcus . Большинство денитрификаторов - хемоорганотрофы. Все денитрифицирующие бактерии - факультативные анаэробы , переключающиеся на денитрификацию только в отсутствие О2. Все денитрифицирующие бактерии — аэробы и могут окислять органическое вещество за счёт кислорода воздуха, но, попадая в анаэробные условия, они используют кислород нитратов как акцептор электрона

Нитрификация

Окисление аммиака до нитрит-аниона

Первая стадия — окисление аммиака до нитрит-аниона, которое осуществляют нитрозные бактерии родов Nitrosomonas, Nitrosococcus и Nitrosospira (ранее выделялись также рода Nitrosolobus, Nitrosovibrio, но сейчас их представители включены в Nitrosospira) по следующему механизму:

NH3 + O2 + НАДН2 → NH2OH + H2O + НАД+

NH2OH + H2O → HNO2 + 4H+ + 4e−

1/2O2 + 2H+ + 2e− → H2O

Ферментом для первой реакции служит аммиакмонооксигеназа, фермент с очень низкой субстратной специфичностью, окисляющая также метан, оксид углерода, циклогексан, фенол, бензиловый спирт, однако со скоростью на порядки ниже. Гидроксиламин ингибирует работу фермента. В бесклеточных экстрактах восстановителем может служить НАД(Ф)·H, однако в клетке его роль, скорее всего, выполняет один из компонентов дыхательной цепи.

Следующую реакцию осуществляет гидроксиламиноксидоредуктаза, расположенная в периплазме. Окислителем в них служит цитохром c, с него электрон передаётся на убихинон и далее в дыхательную цепь, на цитохромоксидоредуктазу и, в конечном итоге, на кислород. При этом запасается энергия в виде трансмембранного протонного потенциала.

Окисление нитрит-аниона до нитрат-аниона

Вторая стадия — окисление аниона азотистой кислоты до аниона азотной, производимое нитратными бактериями (почвенный род Nitrobacter и водные Nitrospira, Nitrococcus, Nitrospina). Процесс протекает в одну реакцию:

NO2− + H2O → NO3− + 2H+ + 2e−

катализируемую нитрит:нитрат-оксидоредуктазой, локализованной в ЦПМ. Далее электроны передаются на цитохромы дыхательной цепи, в которой единственным пунктом транслокации протонов является цитохромоксидаза.

Организмы

Нитрозных и нитритных бактерий ранее выделяли в семейство Nitrobacteraceae, сейчас с развитием геносистематики их рода разнесены по разным подклассам протеобактерий. В кислой среде процесс не идет. Все эти бактерии — грамотрицательные хемолитоавтотрофы, использующие энергию окисления соединений азота для синтеза органических веществ из углекислого газа. Некоторые из них способные переключаться на хемоорганогетеротрофный метаболизм, однако ни одного хемолитогетеротрофа среди данных организмов найдено не было. Морфологически эти группы разнообразны, в большинстве своем мелкие, подвижные, с полярным или перитрихиальным жгутикованием. Окисление они проводят на цитоплазматической мембране.

Гетеротрофная нитрификация

Особо выделяют гетеротрофную нитрификацию, происходящую у многих бактерий и грибов и связанную с окислением аммиака и азота органических соединений без использования полученной энергии, попутно с окислением органического вещества и, предположительно, посредством кислорода, образуемом при разложении пероксида водорода. Удельная активность этого процесса на 2-4 порядка ниже, чем в случае автотрофной нитрификации, однако именно с ним связано происхождение чилийской селитры а также вся нитрификация в почвах и водоемах с низкими значениями pH. (гриб Aspergillusflavus. Arthrobacter, ?)

Культивирование нитрификаторов

Виноградского среда (С.Н. Виноградский, 1856—1953, отеч. микробиолог) —

1) жидкая синтетическая питательная среда для культивирования анаэробного фиксатора азота; содержит глюкозу, двузамещенный фосфат калия, сульфат магния, следы поваренной соли, сульфатов железа и марганца, а также мел;

2) жидкая синтетическая питательная среда для выявления у бактерий способности разлагать клетчатку в аэробных условиях; содержит двузамещенный фосфат калия, сульфаты магния, железа и марганца, поваренную соль, мел и нитрат калия, а в качестве источника клетчатки используется фильтровальная бумага.

Для выявления в почве анаэробных азотфиксаторов используют среды Виноградского и Емцева. Накопительнук культуру Clostridium pasteurianum получают на элективной с р е де Виноградского: глюкоза — 20,0; К2НРО4—1,0 MgS04 — 0,5; NaCl—0,5, вода дистиллированная. Среду разливают в высокие пробирки, на дно которых насыпают по 100— 200 мг СаСО3, стерилизуют при 0,5 атм. Заражают образцам почв.

Питательную среду разливают в высокие пробирки, на дно которых насыпают СаСО3. Стерилизуют при 0,5 атм. Засевают разведениями почвенной суспензии. В случае развития клостридий среда мутнеет, приобретает запах масляной кислоты и в ней появляются пузырьки газа. Микроскопированием убеждаются в наличии клеток бактерий рода Clostridium. Эти бактерии имеют клетки веретенообразной формы, содержащие внутри продолговатую спору. От раствора Люголя они окрашиваются в фиолетово-синий цвет. Численность бактерий определяют методом предельных разведений.

Особо выделяют гетеротрофную нитрификацию, происходящую у многих бактерий и грибов и связанную с окислением аммиака и азота органических соединений без использования полученной энергии, попутно с окислением органического вещества и, предположительно, посредством кислорода, образуемом при разложении пероксида водорода. Удельная активность этого процесса на 2-4 порядка ниже, чем в случае автотрофной нитрификации, однако именно с ним связано происхождение чилийской селитры а также вся нитрификация в почвах и водоемах с низкими значениями pH.

Давно замечено, что нитрификаторы при культивировании в жидких средах в большом количестве располагаются на поверхности частиц мела, песка, окиси алюминия, талька и других адсорбентов, вносимых в среду. Культивирование нитрификаторов в средах без адсорбентов обычно оказывается затруднительным. При очистке питательной среды от твердых взвешенных частиц скорость нитрификации уменьшается. В присутствии адсорбентов нитрификаторы лучше сохраняются как в жидких средах, так и в высушенном состоянии.

Добавление к почве веществ, обладающих большой способностью адсорбировать катионы, в том числе и ион аммония, увеличивает скорость нитрификации. Добавление твердых веществ, не обладающих катионо-обменной способностью, не влияет на скорость процесса.