Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с очень небольшой высотой слоя. Это приводит к необходимости иметь большую поверхность контакта рыхлой среды с воздухом и при отсутствии механизации придает всему процессу неинтенсивный характер, требует больших затрат ручного труда.

Так, например, для завода, вырабатывающего 1 т поверхностной культуры плесневых грибов на пшеничных отрубях, при двухсуточном росте требуется более 1000 отдельных кювет, на которых тонким слоем раскладывается засеянная конидиями гриба питательная среда. Мойка, стерилизация, перемещение кювет внутри цеха, их заполнение и освобождение составляют ту основную трудность, которая характерна для данного метода.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в неасептических условиях, однако как сама среда, так и кюветы первоначально должны быть надежно стерилизованы. Это требование является безусловным, кроме того, перед каждой новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Поверхностный метод имеет и преимущества, самое главное из них — значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культуры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и относительно легко высушить, их легко перевести в товарную форму и транспортировать, если не требуется дополнитель­ной очистки фермента. Положительной стороной поверхностного метода является также меньшая потребность в электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

На рис. 6 приведена принципиальная технологическая схема поверхностного метода выращивания.[2]

Посевной материал.

Для поверхностного метода производства он может быть подготовлен в виде культуры, выращенной на твердой питательной среде, спорового материала или мицелиальной массы продуцента, выращенной глубинным методом. Посевную культуру получают выращиванием микроорганизмов во все возрастающем количестве в три или четыре этапа.

Исходную музейную культуру продуцента, находящуюся на твердой агаризованной среде, пересевают сначала на 1 —1,5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку. Выращивание проводят в термостате до обильного спорообразования. Второй этап осуществляют на той же среде и при тех же условиях, но в колбах, содержащих до 100 г рыхлой среды. Аналогичен и третий этап, но здесь выращивание проводится в сосудах с 500 г среды.

На последнем, четвертом этапе выращивание ведут на посев­ных кюветах, если материал нужен в виде культуры, или отделяют конидий от основной массы мицелия и субстрата на специальном вибросепараторе, если необходимы споры, или, наконец, в инокуляторе объемом 8—10 л на жидкой питательной среде, если инокулят нужен в виде мицелиальной массы.

Можно продлить срок хранения посевного материала, если спороносящую культуру подсушить до влажности 10—12%, отделенные конидии поместить в герметичную тару, а мицелиальную массу охладить до 4—6°С.

Приготовление питательных сред.

Основой почти каждой твердой среды являются пшеничные отруби как источник необходимых питательных и ростовых веществ. В увлажненном состоянии отруби создают требуемую структуру среды. Для повышения активности некоторых ферментов к отрубям добав­ляют свекловичный жом как материал, богатый пектином и целлюлозой, соевый шрот для повышения содержания белков и индукции протеазы, соевую муку или другие включающие жиры материалы для индукции липазы, пивную дробину, обогащенную крахмалом, для стимулирования биосинтеза амилолитического комплекса и др.

Дополнительное введение в отруби растительных отходов — овсяной или рисовой шелухи, соломы, кукурузных кочерыжек и древесных опилок — может улучшить структуру среды, особенно в случае мелких отрубей. Эти отходы вряд ли выполняют роль индукторов, так как большая часть веществ в них находится в нерастворимом состоянии и лигнифицирована. Улучшая структуру и облегчая доступ воздуха, такие материалы обедняют среду и понижают активность получающихся ферментов. Устранить это влияние можно прибавлением источников минерального азота и фосфора, а также материалов, богатых ценными органическими веществами, например солодовыми ростками, упаренным картофельным соком, кукурузным экстрак­том и др.

Таким образом, как и при глубинном методе, изменяя состав среды, учитывая физиологические особенности продуцента и индуцибельность синтезируемых им ферментов, удается в известных пределах управлять процессом культивирования.