Получение товарных форм ферментных препаратов

Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным методом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ: биомассу продуцента, непотребленные компоненты среды, продукты метаболизма. Доля собственно ферментов — активных белков — составляет около 1% для поверхностных и не более 0,1% — для глубинных культур.

Выделение и очистка «ферментов — трудоемкий и дорогой процесс, поэтому, как уже отмечалось, в некоторых случаях ферментные препараты применяют в неочищенном виде: в коже­венной и спиртовой промышленности степень очистки не влияет на качество готовой продукции, введение биомассы продуцента и примесей в корма для животных может даже повысить питательную ценность кормов. В то же время в пищевой промышлен­ности, в бытовом обслуживании, в текстильных и микробиологи­ческих производствах и особенно в медицине могут использоваться только ферменты достаточно высокой, иногда предельной степени очистки.

В лабораторной практике для указанных целей применяют множество препаративных методов в нестандартной последовательности и в самых неожиданных комбинациях. При создании технологии получения высокоочищенных препаратов приходится ориентироваться на разработанные в лаборатории приемы, по­этому на заводах стараются обеспечить возможность мобильного переключения с одной последовательности технологических опе­раций на другую при смене продукта или повышении его качества.

Обсуждая проблемы получения очищенных ферментов, правильнее рассмотреть отдельные технологические стадии, не свя­зывая их в единую технологическую линию. В любом случае, однако, схема очистки сводится к: 1) освобождению от нерастворимых веществ; 2) освобождению от сопутствующих растворимых веществ; 3) фракционированию, как правило, хроматографическими методами. В подавляющем большинстве случаев на первом этапе используют экстракцию фермента.[3,4]

Экстракция из поверхностной культуры. Наилучшим и наиболее употребляемым экстрагентом для белков является вода, но, к сожалению, вместе с ними в воду переходит часть сахаров, не потребленных в процессе роста, полностью гидролизованные гемицеллюлозы и пектиновые вещества, продукты гидролиза целлюлозы и белковых веществ, содержащихся в отрубях, раство­римые пигменты, образуемые плесневыми грибами. На практике механического разрушения мицелия не проводят ввиду больших энергетических затрат. Установлено, что извлекаемость ферментов значительно выше из сухих культур (10—12% влажности), что связано с лучшей проницаемостью воды в под­сушенные клеточные структуры. Ввиду большой молекулярной массы ферменты медленно диффундируют в экстрагирующую жидкость, а из-за их лабильности процесс надо проводить при температурах не выше 30°С. Выход из этого положения — только в увеличении времени контакта культуры с водой.

Отделение твердой фазы. Фильтрация жидкостей, содержа­щих мелкодисперсный клеточный материал, частично разрушен­ные клетки и внутриклеточные биополимеры, осложнена тем, что такая суспензия склонна к гелеобразованию, осадок сжимается и производительность фильтров быстро падает. Это частично предотвращают добавлением в исходную смесь или же предварительным нанесением на фильтровальную ткань вспомогательных фильтрующих материалов — диатомитов, фильтроперлита (размолотые вулканические породы SiO₂, Al₂O₃), кизельгура, бентонита и т. п. На ткани образуются несжимаемые осадки с хорошо развитой пористой структурой, и производительность фильтра­ции снижается значительно медленнее.

Большое значение имеет также коллоидное состояние фильтруемой суспензии. Улучшению процесса фильтрации способствует регулирование рН, добавление флокулянтов или введение 0,1% хлорида кальция, который в присутствии ионов РО₄^3- образует гель фосфата кальция, улучшающий фильтруемость. Однако при решении вопроса о любого рода добавках в фильтруемую суспензию основным моментом является сохраняемость активности фермента, так как известны случаи, когда добавки 4—5% фильтроперлита вызывали потерю ферментативной активности на 52— 58%.

Концентрирование ферментных растворов обычно проводится перед кристаллизацией продукта и чаще всего ограничивается упариванием. Основным условием успешного проведения про­цесса является снижение температуры кипения и уменьшение длительности процесса, поэтому выпаривание обычно проводят не в циркуляционных, а в проточных выпарных аппаратах пле­ночного типа, вслед за которыми сразу же установлены холодильники для резкого снижения температуры и сокращения времени пребывания раствора в нагретом состоянии. При температуре кипения среды 25—35°С температура греющего пара может быть 60—85°С, для ускорения процесса параметры греющего пара можно было бы поднять до 100—120°С, однако температуру кипения раствора фермента тогда надо снизить до 20°С, т. е. обеспечить высокий вакуум. В производственных условиях не всегда возможно достичь глубокого вакуума, поэтому потери фермента из-за тепловой инактивации часто достигают 20 — 25%.

Известно, что чем чище выпариваемый раствор фермента, тем больше его термическая инактивация. В то же время глубокое концентрирование исходной культуральной жидкости или водного экстракта неизбежно приводит к значительному изменению их состава, так как выпадают в осадок гидроксиды, карбонаты и сульфаты магния, меди и других двухвалентных металлов, улетучивается аммиак, продукты разложения некоторых органических веществ, заметно изменяется в сторону подкисления и рН. Все это необходимо учитывать и принимать специальные меры для снижения потерь, поэтому иногда перед упариванием в раствор добавляют специальные стабилизаторы; белки (альбумин, казеин, БВК), хлорид кальция или натрия, другие соли кальция, которые, впрочем, не должны мешать последующей кристаллизации или другим приемам очистки товарной формы препарата.

Ультрафильтрация. В отличие от других способов концентрирования ультрафильтрация позволяет одновременно удалить из растворов все низкомолекуляриые балластные примеси, т. е. она одновременно выполняет функции и концентрирования, и очист­ки. Поскольку процесс основан на разделении веществ по молекулярной массе, он является идеальным именно в применении к очистке ферментов: не требует изменения температуры и фазового состояния, проводится без добавления химических реагентов, позволяет получить теоретически любую необходимую концентра­цию белка и достичь любой заданной степени очистки от примесей.

Осаждение органическими растворителями. Действие органических растворителей основано на снижении диэлектрической постоянной среды, значение которой определяет силы электростатического притяжения и отталкивания. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у белковой молекулы; если разрушить гидратную оболочку, начинается конгломерация и осаждение белков. Для этого молекулы добавляемого вещества должны быть более гидрофильными, чем молекулы белка.

В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. Исходя из механизма процесса, можно понять, почему, используя различное количество растворителя и проводя процесс при различных значениях рН, можно осаждать ферменты фракциями с преобладанием какого-либо одного из них. Например, из 50%-ного этанола осаждается до 80% протеазы и лишь 3—5% амилазы. В то же время до 98% амилазы выпадает при использовании 70% спирта.

Высаливание. Применение этого метода связано с очень большим расходом солей и трудностью их регенерации из маточного раствора, тем не менее в ряде случаев метод находит применение и в заводских условиях. Механизм этого процесса тот же, что и при действии растворителей. Чаще всего как реагент используют сульфат аммония, хорошо растворимый и наиболее дешевый. Применяют также сульфат натрия, сульфат магния, фосфат калия.

Осадок ферментов различной природы образуется за разное время — от 0,5 до 12 ч. Длительность этого процесса, а также расход соли сильно зависят от содержания АСВ в растворе, по­скольку надо связать разное количество воды. Для выделения 1 кг препарата непосредственно из культуральной жидкости надо затратить 45—50 кг соли, а из раствора, упаренного до содержания 30% АСВ, — только около 1,5 кг.

Сорбционная очистка. В молекуле фермента имеются функциональные группы, сообщающие ей при соответствующих значениях рН среды кислотные или щелочные свойства. Поэтому белки обычно способны сорбироваться по ионообменному механизму. Для сорбции белков чаще всего применяют иониты на основе целлюлозы: катионит — карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) и анионит — диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ). В последнее время появилось множество высокоселективных ионитов, из которых можно выбрать наилучший для каждого конкретного случая: термически обработанный крахмал, сефадексы на основе декстрана, аниониты на основе поливинилового спирта, катиониты на основе полиметакриловой кислоты и т. п.

После сорбции и промывки проводят десорбцию элюирующими растворами, специально подбираемыми для каждого сорбента и фермента. Варьируя их расход, можно получить различную концентрацию фермента в элюате. Потери активности обычно не превышают 15%.

Сорбционную очистку проводят либо непрерывно в колонках насадочного типа, либо периодически в аппаратах с мешалкой с последующим отделением твердой фазы.[2,3,4]