Методичка

полі дозволяє розрізнити тільки їхні контури, але не дає можливості розглянути внутрішню будову.

Люмінесцентна мікроскопія заснована на здатності ряду речовин біологічного походження (хлорофіл, вітамін В, деякі алкалоїди й антибіотики тощо) і деяких барвників світитися під впливом падаючого на них світла. Молекули речовин, здатних до люмінесценції, поглинають енергію, переходячи на більш високий енергетичний рівень. Однак у такому стані вони знаходяться нетривалий час і знову повертаються до вихідного енергетичного рівня. Цей перехід супроводжується віддачею надлишку енергії у виді світла – люмінесценцією, причому освітлюваний об'єкт випускає промені енергетично менш багаті, тобто з більшою довжиною хвилі, чим промені збуджуючого світла. Тому викликати люмінесценцію можна або короткохвильовою частиною видимого спектра (синьо-фіолетові промені, λ = 460 нм), або ультрафіолетовими променями (λ= 360...380 нм). В обох випадках виникає люмінесценція в кольоровій гамі видимого спектра, тобто виходить кольорове зображення об'єкта. Більшість мікробних клітин мають дуже слабку власну чи первинну люмінесценцію, тому їх обробляють водними розчинами спеціальних барвників-флуорохромів, до числа яких відносяться акридин жовтогарячий,

берберин та інші.	Електронна мікроскопія. Електронні мікроскопи
	застосовують для вивчення об'єктів і структур,
	розмір яких знаходиться за межами видимості
	звичайних	мікроскопів.		Роздільна			здатність
	електронних мікроскопів 1...40 А°, збільшення в
	середньому 105 разів. Будова електронного
	мікроскопа (рис. 6) в принципі аналогічна
	світлооптичному		мікроскопу,		окремі		вузли
	електронного мікроскопа подібні з вузлами
	звичайного світлового мікроскопа, переверненого
	окуляром униз, але роль світлових променів в
	електронному мікроскопі грає пучок електронів,
	випромінюваних		спеціальним		джерелом			-
	електронною гарматою (1). В електронному
	мікроскопі роль лінз виконує кругове магнітне поле,
	під дією якого електрони можуть відхилятися або
	центруватися. Функція конденсорної лінзи (2)
	електронного	мікроскопа		аналогічна		виконуваній
Рис. 6. Схема дії	конденсором	звичайного		мікроскопа		–	зведення
електронного	пучка електронів у одній крапці на						об'єкті.
мікроскопу	Пройшовши через об'єкт (3), електрони попадають в

об'єктну лінзу (4), що знову фокусує розбіжний пучок і дає перше проміжне зображення об'єкта (5). Магнітний проектор (6) (проекційна лінза, аналогічна по функції лінзі окуляра) дає остаточне збільшення зображення об'єкта (7) на флуоресціюючому екрані - металевій пластинці, покритій тонким шаром сірчистого цинку чи мінералу вілліміту.

11

При влученні на екран електронних променів кожна частка цього шару починає світитися.

Препарати для електронно-мікроскопічних досліджень наносять на спеціальні сітки, на які нанесена найтонша целюлозна чи пластмасова плівка

(підкладка); загальна товщина препарату і підкладки не повинна перевищувати

2500 Ао.

1.6. Правила роботи з мікроскопом

Під час користування мікроскопом необхідно дотримуватися таких правил:

1.Оберігати мікроскоп від пилу, водяної пари, летких хімічних речовин, високої температури, зберігати його у спеціально відведеному місці.

2.Не залишати мікроскоп на сонці, біля запаленого пальника, оскільки може розплавитися канадський бальзам, що склеює лінзи в об’єктивах.

3.Для перенесення з місця на місце мікроскоп потрібно брати лише за тубусотримач і тримати його прямо перед собою, не нахиляючи і не опускаючи донизу, оскільки при цьому окуляр може випасти з тубуса.

4.Перед початком роботи необхідно очистити від пилу оптичну й механічну частини мікроскопа м’якою сухою ганчіркою. Не можна торкатися пальцями лінз об’єктива та окуляра. Об’єктиви очищати лише із зовнішнього боку, не можна їх розгвинчувати і розбирати.

5.Необхідно обережно ставитися до мікрометричного гвинта – не можна обертати його повністю.

6.Обережно працювати з імерсійним об’єктивом: на короткій фокусній відстані можна розчавити покривне скло препарату, що може призвести до появи подряпин на лінзі та зміщення системи лінз в об’єктиві.

7.Після закінчення мікроскопіювання треба підняти тубус і зафіксувати об’єктив у зручному положенні, після чого обережно протерти фронтальну лінзу об’єктива м’якою чистою бавовняною тканиною або фланеллю. Особливу увагу слід звернути на імерсійний об’єктив. Якщо олія не витерта або присохла,

їївитирають тканиною, злегка змоченою у розчині спирту.

8.Після закінчення роботи мікроскоп необхідно перевести у положення

«для зберігання»: обрати об’єктив 8×, на предметному столику розмістити ганчірку, тубус мікроскопа опустити максимально вниз.

1.7. Мікроскопічні дослідження клітин різних організмів

Клітини різних організмів, у тому числі мікроорганізмів, можна вивчати в живому стані (метод роздавленої краплі) і фіксованому. В останньому випадку препарати звичайно забарвлюють.

Метод роздавленої краплі. Для вивчення мікроорганізмів у живому стані на чисте предметне скло наносять краплю дистильованої води. У краплю вносять культуру, змішують з водою і накривають покривним склом. Протилежним кінцем мікробіологічної петлі або голки злегка притискають покривне скло до предметного. Надлишок води видаляють фільтрувальним папером, підносячи його до граней покривного скла.

При перегляді приготовленого препарату під мікроскопом з імерсійною системою зверху на покривне скло наносять краплю імерсійної олії. Метод

12

роздавленої краплі зручний для дослідження рухливості бактеріальних клітин, а також для перегляду великих об'єктів – зерен крохмалю, кристалів солі, цвілевих грибів, дріжджів.

1.8. Техніка мікроскопіювання у світлому полі

Оволодіння навичками приготування мікроскопічних препаратів та технікою мікроскопії найзручніше проводити на прикладі великих об’єктів, найкращими з яких є зерна крохмалю.

Вивчення крохмальних зерен харчової сировини. Крохмаль є найпоширенішим видом запасних поживних речовин рослин, що утворюється в результаті фотосинтезу. У клітинах він утворює зерна, особливо багаті їм клітини насіння і підземних видозмінених пагонів (бульб, цибулин, кореневищ).

У різних рослин форма, будова і розміри крохмальних зерен (картопляного, кукурудзяного, рисового тощо) різні (рис. 7).

Крохмальні зерна мають овальну, сферичну форму або форму багатокутників, розмір яких коливаєтся від 2 до 150 мкм. Зерно картопляного крохмалю, наприклад, має розмір від 10 до 150 мкм; пшеничного – від 30 до 50 мкм; кукурудзяного – від 20 до 30 мкм; рисового – від 5 до 10 мкм. Отже, найбільіші зерна у картопляного крохмалю, найдрібніші – у рисового. Характерна форма крохмальних зерен дає можливість розрізняти їх під мікроскопом, що використовується при виявленні одного виду крохмалю в іншому. Таким чином, форма, розмір і структура крохмальних зерен специфічні для кожного виду рослин. Ця обставина використовується під час аналізу складу борошна і крохмалю, що використовуються в промислових цілях.

1

2

3

4

5

Рис. 7. Зерна крохмалю під мікроскопом: 1 – пшеничного, 2 – картопляного, 3 – житнього; 4 –кукурудзяного; 5 – рисового

13

Завдання на виконання

1. Вивчити будову оптичного мікроскопа, користуючись його описом у лабораторному практикумі та поясненнями викладача.

2.Освоїти техніку визначення загального збільшення, роздільної здатності мікроскопа.

3.Навчитися встановлювати освітлення мікроскопа за використання об’єктива 8×.

4.Для мікроскопічного дослідження будови різних зерен крохмалю приготувати препарати «роздавлена крапля» різних видів крохмалю. Для цього на попередньо підготовлене (промите та висушене) предметне скло нанести краплю води, внести до неї невелику кількість порошку і накрити покривним склом. Для відпрацювання необхідних у майбутньому навичок роботи з культурами мікроорганізмів роботу із приготування препаратів «роздавлена крапля» проводити з дотримаанням усіх правил асептичного відбору проб: створити зону стерильності за допомогою спиртівки, крохмаль відбирати профламбованою бактеріологічною петлею, залишки крохмалю на петлі знищувати фламбуванням.

5.Розглянути зразок крохмальних зерен за умови вибору об’єктива 8×, змінюючи місце положення предметного скла. Результат дослідження у вигляді рисунку занести до лабораторного зошиту. Рисунок оформити у колі діаметром

≈5 см із зазначенням під ним збільшення та вид крохмальних зерен.

6. Нанести біля краю покривного скла краплю слабкого розчину йоду, через 1 хв спостерігати препарат. Крохмальні зерна забарвляться в синій колір, при цьому чітко проглядається їх шаруватість. Результати спостережень у вигляді рисунку незабарвлених і пофарбованих крохмальних зерен знову занести до лабораторного зошиту.

7.Розглянути препарат з об'єктивом 40×. Результати спостережень у вигляді рисунку занести до лабораторного зошиту.

8.Повторити завдання 4 – 7 з іншим видом крохмалю.

Опрацювання результатів

Результати спостережень необхідно занести до протоколу лабораторної роботи 1, у якому повинно бути відображено:

1.Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи.

2.Теоретичні відомості: Основні складові мікробіологічної лабораторії. Основні характеристики оптичного мікроскопу. Будова механічної частини мікроскопа та її призначення. Будова оптичних вузлів мікроскопа та їх призначення. Характеристика методів мікроскопії.Порядок операцій приготування мікроскопічного препарату «роздавлена крапля».

3.Практична частина (рисунки). Рисунки повинні бути оформлені за зразком:

14

Збільшення об’єктива

	Зерна крохмалю	Назва об’єкта дослідження
	картопляного

4.Висновок, у якому необхідно провести порівняльний аналіз форм та розмірів зерен крохмалю різного походження.

Контрольні запитання

1.Охарактеризуйте основні принципи організації мікробіологічної лабораторії та робочого місця мікробіолога.

2.У чому полягають правила техніки безпеки під час роботи в мікробіологічній лабораторії?

3.Які основні частини має оптичний мікроскоп? Яке їх призначення?

4.Які основні характеристики має оптичний мікроскоп? Як їх визначити?

5.Наведіть правила роботи з мікроскопом.

6.У чому полягають особливості техніки мікроскопіювання із використанням сухих та імерсійних об'єктивів?

7.Охарактеризуйте принципи таких методів мікроскопіювання, як темнопольна, фазово-контрастна, люмінесцентна, електронна мікроскопія.

8.Наведіть перелік операції, необхідних для приготування препарату «роздавлена крапля».

9.Дайте порівняльну характеристику форм та розмірів крохмальних зерен різного походження.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 2

Правила роботи з культурами мікроорганізмів. Морфологічні та культуральні ознаки кокових бактерій.

Мета роботи: ознайомитись з будовою бактеріальної клітини, класифікацією та культуральними ознаками кокових бактерій, опанувати методи мікроскопічних досліджень мікроорганізмів, зокрема приготування фіксованих препаратів та препаратів живих клітин.

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні та покрівні скельця; бактеріологічні петлі; спиртівки; крапельниці з дистильованою водою; фільтрувальний папір; імерсійна олія; набір барвників, досліджувані мікробні культури.

15

Загальні відомості

2.1. Будова бактеріальної клітини

Бактерії – типові представники прокаріотів. Більшість бактерій – одноклітинні істоти кулястої, паличкоподібної чи звивистої форми, що розмножуються поперечним поділом клітини в більшості випадків на дві рівні частини. Як правило, поділ відбувається шляхом утворення перегородки. У багатьох бактерій клітини після поділу розходяться, у деяких – залишаються разом. Деякі бактерії розмножуються перешнуровуванням, рідко брунькуванням. Серед бактерій є невелика кількість нитчастих форм.

Всі структурні елементи бактеріальної клітини поділяються на постійні (цитоплазматична мембрана, рибосоми, нуклеоїд, цитоплазма, деякою мірою, клітинна стінка, запасні поживні речовини) та тимчасові або необов’язкові (джгутик, пілі, капсула, плазміда, різновиди мембран (фотосинтетичні, азотофіксувальні, мезосоми тощо) (рис. 8).

Рис. 8. Схема будови бактеріальної клітини

2.2. Класифікація кокових бактерій за морфологічними ознаками

Коки мають форму кулі, діаметр якого коливається від 1 до 2,5 мкм. Під впливом різних факторів середовища коки можуть набувати овальну, сплющену чи еліптичну форму.

16

За взаємним розташуванням клітин, що залежить від способу поділу, їх підрозділяють на групи.

1.Монококи або мікрококи (рід Micrococcus) – поодинокі коки (рис. 9а).

2.Диплококи (рід Diplococcus) – коки, що поділяються в одній площині й утворюють пари клітин, більшість їх – патогенні (рис. 9б).

3.Стрептококи (рід Streptococcus) – поділяються також в одній площині, але клітини не відокремлюються одна від одної і утворюють ланцюжки (рис. 9д).

4.Тетракоки – поділяються в двох взаємно перпендикулярних площинах і утворюють групи з чотирьох клітин (рис. 9в).

5.Сарцини (рід Sarcina) – поділяються в трьох взаємно перпендикулярних площинах і утворюють скупчення (пакети) кубічної форми (рис. 9г).

6.Стафілококи (рід Staphylococcus) – поділяються безладно в декількох площинах, утворюють скупчення, що нагадують за формою гроно винограду

(рис. 9е).

Коки в основному нерухливі, не утворюють спор, грампозитивні.

Рис. 9 Форми кокових бактерій:

а – мікрококи, б – диплококи, в – тетракоки, г – сарцини, д – стрептококи, е – стафілококи.

Мікрококи або монококи (рис. 9а) є стійкими мікроорганізмами, добре розвиваються у широкому діапазоні температур (22...40ºС) за найрізноманітніших умов: у молочних продуктах, у ґрунті, пилу, розсолах, морській воді і багатьох не занадто кислих харчових продуктах. Більшість є сапрофітами. Майже усі види на твердих середовищах утворюють колонії маслянистої консистенції, забарвлені у білий чи жовтий колір. Зустрічаються також різні відтінки від червоного до жовтогарячого.

Найбільш розповсюджені види: Micrococcus		agilis, M. flavus, M. luteus,
M. roseus, M. freudenreichi (рис. 10).
	Форма клітин переважно овальна (d = 0,5...1 мкм).
	Деякі види мають промислове значення, їх застосовують
	у сироварінні, оскільки вони розщеплюють казеїн і лактозу з
	утворенням ароматичних сполук.
	Стрептококи (рис. 9д) – грам позитивні бактерії,
	утворюють ланцюжки різної довжини, живуть у кишечнику
Рис. 10. Електронна	людини і тварин, молочних і багатьох інших харчових
мікроскопія	продуктах, потрапляють у стічні води. Відомі групи
Micrococcus luteus	гемолітичних, фекальних і	«молочних» стрептококів.

17

Рис. 11. Електронна мікроскопія

Streptococcus lactis

Найбільше практичне значення мають види Streptococcus lactis, S.cremoris, S. diacetilactis, S.thermophilus, S.faecalis, Leuconostoc mesenteroides тощо.

Streptococcus lactis (стрептокок молочний) (рис. 11) викликає скисання молока і використовується в молочній промисловості для виготовлення кефіру, сиру, сметани. Виявляється в коров’ячому молоці, гної, у пилу, ґрунті, на рослинах і посуді. Швидко росте в молоці за 25ºС. Форма

	клітин переважно овальна (d = 0,5...1 мкм).
	Бактерії Leuconostoc mesenteroides (рис. 12)
	утворюють одиночні клітини, диплококи чи ланцюжки.
	На середовищі із сахарозою утворюють капсули, які
	можна виявити, забарвлюючи препарати розведеною
	тушшю. Колонії слизуваті, майже безбарвні, опуклі,
	великі (d до 2-4 мм). Завдають великої шкоди цукровій і	Рис. 12. Електронна
	спиртовій промисловості, що переробляє мелясу. Широко	мікроскопія
		Leuconostoc
	розповсюджений у товарному цукрі, мелясі, капусті,
		mesenteroides
	силосі й інших, багатих на вуглеводи, рослинних

продуктах. Здатні продукувати екзополісахариди, що знаходить своє застосування у біотехнології при одержанні кровозамінників, сефадексів тощо.

		Сарцини (рис. 9г, 13) – коки, що групуються в
		кубоподібні пакети різної величини. Число коків у пакеті
		кратне восьми. Це сапрофіти, які розвиваються в
		рослинних продуктах, що бродять, головним чином у
		пивному суслі, пиві і засівних дріжджах. У результаті їх
		життєдіяльності пиво скисає, каламутніє і набуває смаку і
		запаху меду («сарцинова хвороба»).
		Сарцини широко поширені в природі: у воді, ґрунті,
Рис. 13. Електронна		повітрі (на часточках пилу), на зерні, солоді (види Sarcina
мікроскопія		lutea, S. flava, S. maxima, S. aurantica).
Sarcina flava		Стафілококи (рис.		9 е,	14). Їх
		можна знайти на шкірі і слизових
оболонках рота і носа, а також у багатьох харчових
продуктах.	Найчастіше		зустрічаються	два	види:
Staphylococcus aureus утворює золотисто - жовтий пігмент і
Staphylococcus albus – утворює білий пігмент. Вони є
збудниками маститу, фурункульозу, харчових отруєнь.						Рис. 14. Електронна
Використовуються		як тестові культури для		визначення
активності	певних	антибіотиків (ампіциліну,		цефазоліну,		мікроскопія
						Staphylococcus aureus
канаміцину тощо)

18

2.3. Культуральні ознаки бактерій

До культуральних (макроморфологічних) особливостей відносять характер росту мікроорганізмів на рідких та твердих поживних середовищах.

На поверхні щільного поживного середовища мікроорганізми можуть рости у вигляді окремих колоній, суцільно за штрихом та газоном.

Колонія – це ізольоване скупчення клітин одного виду, які виросли, як правило, з однієї клітини. Залежноі від того, де розвинулись клітини розрізняють: поверхневі, глибинні та донні колонії.

Колонії, що розвинулись на поверхні відрізняються великою різноманітністю (рис. 15).

Рис. 15. Форма колоній: а – кругла; б – кругла з фестончастим краєм; в – кругла з валіком по краю; г, д – ризоїдальні; е – з ризоїдальним краєм; є – амебоподібна; ж – нитчаста;

з– складчаста; и – неправильна; і – концентрична; к – складна.

Упроцесі їх опису враховують наступні ознаки:

•форму колоній – кругла, амебоподібна, неправильна, ризоїдна тощо;

•розмір (діаметр) колонії, який вимірюють у мм;

•поверхню колонії – гладенька, шорстка, борозниста, складчаста, зморшкувата, із концентричними кільцями тощо;

•профіль колонії – плоский, випуклий, кратероподібний, конусоподібний тощо;

19

•блискучість та прозорість – колонія блискуча, матова, тьмяна, борошниста, прозора;

•колір колонії – незабарвлені (колонії брудно-білого кольору відносять до незабарвлених) або пігментовані: білі, жовті, золотисті, оранжеві, бузкові, червоні, чорні. Окремо звертають увагу на виділення пігменту у середовище.

•край колонії – рівний, хвилястий, зубчастий, бахромчастий та інші; структуру колонії – однорідна, дрібноабо великозернисті, волокнисті та

інші.Край та структуру колонії визначають за допомогою лупи; консистенцію колонії визначають під час торкання до її поверхні петлею. Колонія може легко відокремлюватися від середовища або вростати в агаризоване середовище, бути твердою, м’якою, слизуватою, тягучою, крихкою.

Глибинні колонії, навпаки, досить одноманітні. Найчастіше вони мають вигляд сплющених чечевичок. Лише деякі можуть мати вигляд пучечків вати з нитчастими виростами у поживне середовище. Утворення глибинних колоній часто супроводжується розривом щільного середовища, якщо мікроорганізми виділяють вуглекислоту або інші гази.

Донні колонії мають, як правило, вигляд прозорих плівок, що стеляться по

дну.

Розміри та деякі інші особливості колоній мікроорганізмів змінюються з віком, залежать від складу середовища та температури вирощування, тому, при описанні колонії, вказують ці критерії.

Ріст у рідкому поживному середовищі більш одноманітний і супроводжується помутнінням середовища, утворенням плівки або осаду. При цьому відмічають ступінь помутніння (слабка, помірна або сильна), особливості плівки (тонка, щільна або рихла, гладенька або складчаста), а при утворенні осаду вказують – бідний він чи суттєвий, щільний, рихлий, слизоподібний або пластівцевий

2.4. Методи мікроскопічних досліджень мікроорганізмів

Мікробна клітина – складна жива система, характеризується високим ступенем впорядкованості складових її структур. Кожна структура виконує певне життєве призначення. Взаємодія структур забезпечує існування клітини, її цілісність.

Для вивчення внутрішньої будови клітин застосовують спеціальні методи забарвлення (цитохімічні методи дослідження). Багато з цих методів переслідують діагностичні цілі. За формою клітини мікроорганізми не дуже різноманітні, і в ряді випадків, щоб встановити приналежність мікроба до того чи іншого роду й виду, необхідно провести спеціальне забарвлення тієї чи іншої структури (або речовини, накопичувальної в клітині).

Морфологічні та цитологічні особливості мікроорганізмів можна вивчати, використовуючи різні методи мікроскопії, а також застосовуючи методи диференційного забарвлення. Існує ряд прийомів, які лежать в основі більшості спеціальних методів дослідження морфології й цитології бактеріальних клітин.

20