фарм. и аналит. химия / аналит. химия / Зайцев. Аналітична хімія

теплопровідностей газу-носія і речовини, що досліджується, тим вища чутливість ДТП. Тому ліпше використовувати як газ-носій водень або гелій, які мають найбільшу теплопровідність з усіх газів.

ДТП	-	детектор	універсальний, він		реєструє	всі	сполуки,			що
витікають	з	колонки,	оскільки теплопровідність			- це	властивість,
		.	М	ежа визначення катарометра становить				10·12	І	см	3
притаманна ВСІМ газам.									г
при діапазоні лінійності 105.
Полумєнєво-іонізаційнuй детектор					(ПІД).	Принцип роботи

nолуменево-іонїзаЦlllllого детектора полягає у вимірюванні сили

електричного струму, який проходить через іонізований газ між двома

електродами.

Г·

Н,

Рис. 4.8. Схема полуменево-іонізаційного детектора:

1 - введення газу з колонки; 2 - введення повітря; 3 - катод;

4 - колекторний електрод; 5 - вихід газу в атмосферу Газ, що виходить з колонки, змішується з Н2 і поступає у форсунку

пальника детектора (рис. 4.8). Іонізовані частинки, що утворюються в

полум'ї, заповнюють міжелектродний простір, внаслідок чого струм різко

підсилюється. Тобто концентрацію іонів визначають, вимірюючи

провідність полум'я. ПІД реагує практично на всі сполуки, окрім Н2О, Н2,

інертних газів, 02, N2, оксидів азоту, сірки та карбону. Цей детектор

чутливий до сполук, що іонізуються в полум'ї, тобто до сполук з с-с та с­

Н зв'язками, тобто селективний до органічних сполук. Межа визначення

цього детектора дорівнює 10·12 гІс за діапазuну лінійності 107.

Детектор елекmРОlllюго захоплення. Детектор складається з комірки з двома електродами (іонізаційна камера) (рис. 4.9), в яку поступає газ, що

витікає з хроматографічної колонки. У камері газ опромінюється

постійним потоком fJ-електронів, оскільки один з електродів виготовлений

.	(63	' 3	1JБ	)	fЗ'	н ~б'
з матерІалу		NІ,	н,--	Rа, що є джерелом	-ВИПРОМІНення.	аи ІЛьш

зручне джерело випромінення - титанова фольга, що містить адсорбований

тритій. Газ-носій іонізується під дією потоку частинок від радіоактивного

131

джерела N2 ~ N/ + е 1 таким чином в комірці створюється стала

концентрація електронів, тобто стала сила струму.

4

+

Рис. 4.9. Схема детектора захоплення електронів: І - введення газу; 2 - джерело випромінення; 3 - виведення газу в атмосферу; 4 - електроди

Концентрацію електронів, що утворюються, вимірюють за

допомогою системи електродів, подібної до тієї, що використовується в

полуменево-іонізаційному детекторі. При попаданні в камеру молекули

речовини захоплюють вільні електрони з утворенням стабільних аніонів:

АВ + е = АВ- ± енергія АВ + е = А + В- ± енергія

Внаслідок зменшення концентрації електронів струм між

електродами зменшується пропорційно концентрації цієї речовини.

Цей детектор селективний до сполук, що містять галогени, фосфор, сірку, також до нітратів, плюмбуму, кисню, металоорганічних сполук. На більшість вуглеводнів він не реагує. Застосовувати як газ-носій аргон

небажано, оскільки його збуджені атоми можуть викликати побічні явища.

Межа визначення ЕЗД складає 10-14 гІс, лінійний діапазон - 102.

4.6. Рідинна хроматографія

Всі хроматографічні різновиди, в яких рухома фаза - рідка, називаються рідинною хроматографією. Певний час рідинна

хроматографія використовувалась лише з препаративною метою, але за

останні 30 років вона перетворилася на високоефективну рідинну

хроматографію (ВЕРХ) і посіла належне місце в аналітичних лабораторіях як ЗРУЧНИЙ метод кількісного аналізу. Цьому сприяли створення нових хроматографічних колонок з щільно упакованими високодиспеРСІІИМИ

сорбентами, через які рідина може протікати тільки під тиском, відповідно

до цього удосконалення насосних систем; розробка нових високочутливих детекторів, комп'ютеризація керування хроматографом.

Рідинна хроматографія поділяється залежно від агрегатного стану нерухомої фази на:

132

•

рідинну

адсорбційну (розділення речовин відбувається

завдяки відмінності в адсорбційній здатності речовин);

•рідинно-розподільну (розділення грунтується на різній розчинності речовин у рідких фазах, що не змішуються);

•гель-проникну (розділення відбувається за рахунок різної 'здатності макромолекул проникати в пори сорбенту).

Залежно від механізму взаємодії сорбент - сорбат рідинна хроматографія буває:

•молекулярна (розподіл молекул між двома фазами);

•іонообмінна (обмін іонів між двома фазами).

Рідинну хроматографію можна виконувати в колонці і на площині

(паперова, тонкошарова).

На відмінність від газу-носія, який виконуючи тільки транспортну функцію, майже не сорбується, не взаємодіє з молекулами сполук, що

досліджуються, рідка рухома фаза - активна речовина, молекули якої

можуть сорбуватися на поверхні і взаємодіяти з молекулами сполук за

рахунок Ван-дер-Ваальсових сил. При проходженні крізь колонку молекули компонента, який визначають, що знаходяться в елюенті, повинні витіснити молекули елюенту з поверхні сорбенту.

Селективність в рідинній хроматографії, на відмінність від газової, визначається не одним, а двома чинниками - хімічною природою рухомої і нерухомої фаз.

Рухома фаза. Рухома фаза повинна добре розчиняти компоненти

проби; бути хімічно інертною по відношенню до нерухомої фази, компонентів проби і всіх частин хроматографа; мати малу в'язкість;

забезпечувати високу чутливість детектора; бути чистою; екобезпечною.

Зазвичай елюент - це суміш 2-З-х розчинників. Щоб ефективно

використовувати багатокомпонентний елюент, треба знати хімічні і

фізичні властивості як окремих розчинників, так і суміші, яка отримується. Складовими рухомої фази можуть бути такі розчинники як вода, формамід,

етанол, диметилсульфоксид, піридин, ацетонітрил, тетрагідрофуран, етилацетат, ацетон, етиленхлорид, хлороформ, етиловий етер, бензол,

діізопропіловий етер, тетрахлорид вуглецю, циклогексан, гексан, н-пентан

тощо.

Як і в газовій хроматографії, вибір розчинника залежить від класу

сполук, що досліджуються, і типу детектора.

Склад рухомої фази під час елюювання може зберігатися сталим (ізократl/чне елююван//я) або змінюватися (градієнтне елюювання).

Градієюnне елюювання - це змішування елюентів у змінній пропорції. Градієнтне елюювання застосовують у випадку розділення суміші речовин з широким діапазоном полярності.

Основною хроматографічною характеристикою розчинника є його

елююча СlJла (&") або здатність десорбувати речовини з адсорбенту.

133

Елююча сила розчинника показує, у скільки разів енергія сорбції даного елюенту більша за енергію сорбції елюенту взятого за стандарт, наприклад н-пентану. За визначенням, елююча сила ІІ-пентану дорівнює О (для десорбції з полярних адсорбентів). Елююча сила елюенту залежить від

природи функціональних груп речовин, полярності, діелектричної сталої

розчинників.

На основі зіставлення елюючої сили складені так звані елюотропні ряди

елюентів (табл. 4.4). Користуючись значенням Е", можна прогнозувати

приблизний склад рухомої фази.

Таблиця 4.4. Елюотропний ряд та			елююча сила			деяких		розчинників
(елюентів)
						Зростання елюючої
Елюент	Елююча		Діелектрична			сили при елююванні з
	сила*		стала				адсорбентів
						полярних		неполярних
Вода	Дуже велика		80,4
Формамід	Велика		110
Метанол	0,95		33,6
Етанол	0,88		25,8
Диметилсульфоксид	0,75		48,9
Ацетонітрил	0,65		37,5
Тетрагідрофуран	0,62		7,58
Ацетон	0,56		21,4
Етиленхлорид	0,49		10,7
Бензол	0,32		2,3
Діізопропіловий етер	0,28		3,8
Тетрахлорид вуглецю	0,18		2,2
Гексан	0,00		1,88
ІІ-Пентан	0,00		1,84

*Виражено у відносних одиницях при десорбції з А12Оз.

Елюенти поділяють на сильні й слабкі. Чим сильніший елюент, тим краще він десорбує, тим менші значення часу утримування мають речовини, що досліджуються.

Рідинний хроматограф. На рис. 4.10 представлена схема

хроматографа для ВЕРХ.

134

Рис. 4.10. Принципова схема рідинного хроматографа дЛЯ ВЕРХ: І - рухома фаза; 2 - фільтр; 3 - насос; 4 - термостат; 5 - колонка; 6 -

детектор

Елюенти з резервуарів 1, ПРОХОДЯ4И крізь вхідний фільтр 2 і

дегазатор, подаються в колонку за допомогою насоса 3. Проба вводиться в

інжектор, звідки вимивається рухомою фазою і потрапляє в колонку 5. Колонка знаходиться в термостаті колонок 4. Розділені речовини з потоком елюенту потрапляють у детектор 6. Елюент зливається в резервуар. Всі

блоки керуються комп'ютером.

Елюенти зберігаються у спеціальних резервуарах. Вхідний фільтр очищує елюенти від мікрочасточок, які можуть забруднити насос і

колонку. В дегазаторі розчинники очищують від газів (повітря), які можуть

накопичуватися в колонці і детекторі у вигляді бульбашок і заважати

роботі. Дуже шкідливими є бульбашки кисню, який поглинає в УФ ділянці

спектра і є електрохімічно активним. Дегазатором може бути УФ-баня,

вакуумна система.

Рухому фазу прокачує крізь колонку насос, що складається з корпусу

і плунжера. Корпус виготовляють з неіржавіючої сталі, плунжер

найчастіше із сапфіру. В корпусі є невелика порожнина. ІІереміщення плунжера в порожнину і назад призводить до подачі в колонку елюенту.

Сучасні насосні системи є двохплунжерними. В цьому разі не виникає пульсацій потоку.

Хроматографічні колонки. Класифікація колонок за способом заповнення і призначенням така сама, як і газовій хроматографії. Відрізняються тільки параметри: капілярні - довжина від 25 см, внутрішній діаметр І - 0,25 мм, ефективність понад 250 ООО тарілок, аналітичні набивні - довжина 3 - ЗО см, внутрішній діаметр 2 - 5 мм,

ефективність понад 1ОО ООО тарілок, препаративні набивні - довжина ІО -

1ОО см, внутрішній діаметр 5 - 25 мм, ефективність менш як 5000 тарілок. Швидкість подаЧІ елюенту залежить від розмірів насоса.

Мікронасоси створюють швидкість 1-500 мкл/хв, аналітичні - 0,1-10

мл/хв, препаративні - понад 5 мл/хв.

135

Пробу можна вводити шприцом або за допомогою автосамплера. За допомогою шприца проба вводиться в "петлю" (трубка відомого об'єму)

проколюванням еластичної мембрани, звідки вона вимивається рухомою

фазою в колонку.

При використанні мікроколонок об'єм проби становить 1-5 МКЛ. Детектори. На теперішній час запропоновано більше 20 типів

детекторів для рідинної хроматографії. Їх можна поділити на такі групи:

спектрофотометричні (спектрофотометричний детектор (СМД) з фіксованою довжиною хвилі або з матрицею діодів, флуориметричний (ФД), рефрактометричний (РД), атомно-абсорбційний (ААД)),

електрохімічні (полярографічний (llД), кондуктометричний (КД), детектор

електропровідності (ДЕ», мас-селективний (МС».

Рефрактометричний детектор. Принцип дії рефрактометричного детектора з відхиленням променя полягає в тому, що світло на межі скла, з якого виготовлена проточна кювета, і рідини в кюветі відхиляється за рахунок заломлення. Ступінь цього відхилення залежить від коефіцієнта заломлення n розчину і тангенса внутрішнього кута а кювети. Детектор містить дві кювети: робочу і порівняння. Через робочу проходить елюат.

Кювету порівняння врівноважують з рухомою фазою до початку аналізу.

Випромінення від джерела проходить крізь робочу кювету, потім крізь кювету порівняння. У кюветі порівняння знаходиться рухома фаза. Коли крізь робочу кювету проходить рухома фаза, промінь на виході не відхиляється. Коли крізь робочу кювету проходить елюат, промінь відхиляється на кут <р. Інтенсивність опромінення фотоелемента змінюється. Зміна сигналу детектора витікає з закону Снеля: <р = (nl - n2)tga, де nl і n2 - показники заломлення рідини, відповідно у робочій і кюветі порівняння, а - внутрішній кут кювети.

При роботі з рефрактометричним детектором важливо враховувати,

що показник заломлення сильно залежить від температури. Треба ретельно

термостатирувати детектор. Не можна користуватися детектором в

градієнтному режимі. Перевагою є те, що детектор недорогий

універсальний.

Межа виявлення становить 1О нг/мл. Діапазон лінійності - 104.

Спектрофотометричний детеюnор. Принцип дії СФД полягає у вимірюванні оптичної густини елюату (А = Jgljl) порівняно з оптичною густиною елюенту. Основна залежність описується законом Бугера­

Ламберта-Бера А=єі·С, де А - оптична густина; є - молярний коефіцієнт поглинання; І - товщина кювети, см; С - концентрація речовини в кюветі, моль/л. Чутливість СМД тим більща, чим більший молярний коефіцієнт

світлопоглинання (є) компонентів, а елюент не поглинає в УФ або видимій

ділянці спектра. Об'єм проточної кювети цього детектора менше І О мкл. Існують дві основні конструкції СФД: з фіксованою довжиною хвилі

і діодно-матричниЙ.

136

Джерелом випромінення в обох конструкціях є високоінтенсивна

дейтерієва лампа для УФ-діапазона і вольфрамова лампа розжарювання для видимого діапазону. Далі в детекторі з фіксованою довжиною хвилі

розташовується монохроматор, який пропускає на кювету випромінення тільки певної довжини хвилі. Перед кюветою і після неї розташовуються

фокусувальні лінзи, щоб якомога більша частина випромінення проходила через кювету. Далі послаблене випромінення потрапляє на фотодіод.

Спочатку вимірюють фоновий сигнал, пропускаючи через кювету елюент. Як тільки через кювету проходить елюат з компонентом суміші,

інтенсивність випромінення, яке пройшло через кювету, зменшується.

Принцип дії діодно-матричного детектора такий самий, за виключенням того, що монохроматор не використовується. Випромінення,

що пройшло через кювету розгортається у спектр по довжинам хвиль за

допомогою дифракційної решітки. Вздовж дуги спектру розташовані

фотодіоди певної ширини. Кожний з діодів приймає сигнал з певної ділянки спектру поглинання.

Перевага СМД з фіксованою довжиною хвилі полягає у простоті обладнання, низькій вартості. Діодно-матричний детектор коштує більше, але дозволяє не тільки визначити вміст речовини, але й будувати спектр поглинання для ідентифікації речовини.

Межа виявлення складає 1 нг/мл.

ФЛУОРllметРllЧl/lIЙ детектор. В процесі флуоресценції молекула поглинає УФ випромінення, збуджується, після чого відбувається

релаксація і випромінювання на більшій, специфічній для даної молекули,

довжині хвилі у видимій області. Це свічення і сприймає світлочутливий

елемент детектора.

Детектор селективний і високочутливий. ІІри роботі з детектором

треба строго контролювати рН і склад рухомої фази, підбирати такі

елюенти, які не гасять флуоресценцію. Також треба ретельно термостатірувати кювету. Межа виявлення складає І пг/мл.

КОl/дуктометРUЧI/UЙ детектор. Застосовується в іонній хроматографії для вимірювання провідності розчинів, яка пропорційна

концентрації іонів в розчині, їх рухливості. Межа виявлення дорівнює

п·IО-3 мкг/мл.

4.7. Ситова (гель-проникаюча, молекулярно-ситова, ексклюзійна) хроматографія

Цей вид хроматографії є різновидом рідинної хроматографії, в якій

розділення компонентів СУМІШІ грунтується на РОЗПОДІЛІ молекул

відповідно їх розмірам між розчинником, який знаходиться в порах

сорбенту, і тим самим розчинником, який тече між його гранулами. Отже,

137

на відміну від усіх інших методів хроматографічного аналізу в гель­ хроматографії нерухомою і рухомою фазами є одна й та сама речовина -

розчинник.

у процесі розділення невеликі за розміром молекули дифундують у сорбент, у порах якого знаходиться рідка нерухома фаза, а великі

молекули, розмір яких перевишує діаметр пор (каналів) сорбенту, не

проникають у нього і вимиваються з колонки рухомою фазою. Чим менший розмір молекул, ти глибше вони дифундують у пори, тим пізніше вимиваються з колонки. Таким чином, чим більший розмір молекул, тим

менший час утримування вони мають.

Хроматографію, яка rpунтується на розподілі молекул відповідно до їх розмірів, У літературі називають по-різному: молекулярно-сuтовою,

якщо для розділення молекул використовують цеоліти, які інакше називають молекулярними ситами; гель-nрО/шкною, якщо для розділення

застосовують полімерні сорбенти, які набухають в органічних розчинниках (полістирол), або гель-фільтраційною, у випадку використання сорбентів, які набухають у воді (сефадекс).

у гель-хроматографії як носії використовують: м'які гелі - органічні полімери, такі як целюлоза, полістирол, полідекстран, агароза, поліакриламід, які сильно набухають і мають високу ємність за розчинником; жорсткі гелі, такі як силікагель, скло, які мало або зовсім не набухають і мають фіксований розмір пор.

Для розділення речовин із водних розчинів зазвичай використовують гідрофільні гелі на основі декстрину - поліатомного спирту, який

складається 1З залишків глюкози. Декстрани, зшиті нитками

епіхлоргідрину, підготовлені для хроматографії мають фірмову назву -

сефадекси. Розділення з органічних розчинників проводять на гідрофобних

полістиролах, що мають різний ступінь зшивання (стирогель, порагель

тощо).

Гель-хроматографію застосовують для відокремлення дуже великих молекул, розміри яких значно більші за розміри пор сорбепту, від малих

молекул (іонів), які вільно проникають у фазу сорбенту. Такий процес відбувається, наприклад, при знесоленні білків та інших природних високомолекулярних сполук або при очищенні гемоглобіну від кухонної

солі (див. рис. 4.11) тощо.

138

л

CNaCJ•

МГ/МЛ

10

1.<1

100

Рис. 4.11. Очищення гемоглобіну (1) від кухонної солі (2) на сефадексі а-25.

Колонка - 4 ммх85 см. Елюент - вода (240 мл/год).

А - оптична густина елюенту при 280 нм

Також цей різновид хроматографії використовують для розділення комплексних сполук металів, зокрема тих, що утворюються в природних водах з органічними лігандами різної молекулярної маси, і для визначення молекулярних мас органічних сполук, полімерів синтетичного і природного походження і комплексів металів з високомолекулярними

органічними лігандами. Для цього потрібно підібрати сорбент із розмірами

пор, близькими до розмірів молекул речовин, молекулярну масу яких визначають, і попередньо проградуювати хроматографічну колонку з використанням відомих (стандартних) сполук, близьких за будовою до тих,

що визначаються. Ця вимога зумовлена тим, що швидкість дифузії

молекул із зовнішнього розчину у внутрішній і назад залежить не стільки від їх молекулярної маси, скільки від розміру та структури, а також від здатності до сольватації (гідратації) молекулами розчинника (води).

Для детектування сполук у гель-хроматографії можна використовувати спектрофотометричний і рефрактометричний детектори.

Частіше застосовують рефрактометричний детектор, оскільки він є універсальним і витримує високі температури, необхідні для аналізу

високомолекулярних ваЖКОРОЗЧИIІНИХ полімерів.

4.8. Іонообмінна, іонна хроматографія

Принцип методу. В основі іонообмінної хроматографії лежить динамічний процес обміну іонів, які знаходяться у фазі сорбенту, на іони з

розчину.

Сорбенти, які можуть обмішовати свої рухомі іони, називають іОl/ооБJніннuмu сорбентами або іОl/ітами. Частину матриці іоніту, що несе

один позитивний або негативний заряд, позначають літерою R. Ці заряди

на сорбенті компенсовані протиіонами, наприклад, іонами н+ (RH) або он'

(ROH), або іншими катіонами чи аніонами. У першому випадку маємо

139

катіонообмінний сорбент (катіопіт), а в другому - аніонообмінний сорбент (аніоніт).

у загальному вигляді обмін рухомих іонів, якими заряджений

сорбент мт± на іони Nn± можна зобразити такою рівновагою nRonM + m N n' <=> mR,N + n мт±.

Стан іонообмінної рівноваги залежить від сорбційної здатності іонів

мт± і Nn±, також від їх концентрації в розчині та у фазі іонообмінного

сорбенту. Тому рівновага може бути зсунута вправо або вліво зміною

	концентрації іонів мті та Nn± у розчині або у фазі сорбенту. При цьому
	концентрацію іонів у розчині виражають у моль-екв/л, а у фазі сорбенту -
	у ммоль-екв/г або в моль-екв/кг.
	Обмін іонів є зворотним процесом і відбувається в еКВІвалентних
І	співвідношеннях, наприклад:
		RH+Na t	<=>	RNa +Н+,
ІІІ		З R Ca + 2А13		+ <=> 2 R, Al + ЗСа2+ ,
		2
		ROH + СІ- <=>		RCl + ОН- .
11	За хімізмом	сорбції	методи іонообмінної хроматографії
	відрізняються від методів, які rрунтуються на РОЗПОДІЛІ молекул. Проте
\	загальні закономірності просування хроматографічних зон іонів, так само

Ітеоретичних тарілок та дифузійної теорії.

ІІонообмінні сорбенти. Будь який іоніт можна розглядати як матеріал, що складається з матриці, яка не бере безпосередньої участі в іонному обміні, та іоногеНІ/их груп, які містять рухомі іони, здатні до

обміну.

За структурою матриці розрізняють неорганічні та органічні іоніти.

Приклади природних неорганічнuх іонітів: алюмосилікати (анальцитяк і молекул, крізь шар сорбенту можна описати за допомогою теорії

Na[AISi20 6}H20,	фозатит	Ca,Na2[AI2SisOI4]-6Н20,	каолініт
AI2[Si20s]·(OH)4);	СИЛlкати (серпентиніт Мg6[Sі4ОЮ]'(ОН)R,		тремоліт

Са2Мgs[Sі9022]·(ОН)2).

Серед сuнтетичних неорганічних іонообмінних сорбентів

використовуються модифіковані силікагелі, штучний алюмосилікат пермутит, оксид алюмінію, цирконілфосфат, малорозчинні солі гетерополікислот, фосфати й амфотерні гідроксиди багатовалентних металів (стануму, цирконію, титану, ніобію, вольфраму).

До органічних іонообмінних сорбентів відносяться синтетичні високомолекулярні органічні сполуки - іонообмінні СМОЛlI, до складу яких

входять іонообмінні (іоногенні) групи, а також целюлозоіоніти - продукти

хімічно модифікованих целюлозних порошків та волокнистих целюлоз. Для синтезу високомолекулярних сполук використовують реакції

полікондесації або полімеризації органічних сполук. Наприклад,

140