2.2. Хроматография

2.2.1. Сущность метода. Его применение в биологии и медицине

Хроматография является эффективным методом разделения, анализа и физико-химического исследования веществ. В его основе лежат различия в адсорбционных или иных свойствах соединений, благодаря чему они по-разному распределяются между адсорбентом и проходящей через его слой жидкостью или газом.

Основоположником хроматографического метода и самого термина «хроматография» является русский ботаник М.С. Цвет. В 1903 году он опубликовал работу о разделении хлорофилла на компоненты, пропуская его раствор через трубку, заполненную адсорбентом СаСО₃ (рис. 2.20). При этом был получен ряд окрашенных полос-зон, соответствующих отдельным пигментам, что послужило основанием для названия метода хроматографией (цветоописанием). Тогда же М.С. Цвет указал на возможность разделения и бесцветных соединений.

Сущность хроматографического метода заключается в том, что через слой адсорбента, являющегося неподвижной фазой, пропускают поток элюента – жидкости или газа-носителя (подвижная фаза), содержащего в своем составе разделяемую смесь. Встречая на своем пути свободную поверхность адсорбента, со свободными адсорбционными центрами, компоненты разделяемой смеси адсорбируются и, если их адсорбционная способность различна, смесь разделяется на зоны, каждая из которых преимущественно содержит чистое вещество. Раньше других на адсорбенте всегда связывается компонент, наиболее прочно адсорбирующийся. Последним адсорбируется вещество, имеющее слабое сродство к адсорбенту. Неадсорбирующиеся компоненты выйдут из слоя адсорбента вместе с элюентом.

При дальнейшем пропускании чистого элюента сорбировавшиеся зоны начнут двигаться по слою адсорбента, вследствие непрерывно идущего процесса адсорбции-десорбции, и подхваченные током жидкости или газа будут выходить с элюентом в определенной последовательности: первыми – наиболее слабо сорбирующиеся, последними – сильно сорбирующиеся. На выходе с адсорбента компоненты фиксируют либо с помощью автоматических детекторов (в газовой и жидкостной хроматографии), либо путем отбора фракций раствора и анализом их методами спектрофотометрии, рефрактометрии и т.д.

После завершения хроматографического разделения результаты представляют в виде графика, откладывая по оси ординат концентрацию компонента в зоне, а по оси абсцисс – объем пропущенного через адсорбент растворителя (элюента) или время. Таким образом, для построения графической хроматограммы необходимо определить концентрацию каждого компонента в его зоне, последовательность расположения зон и расстояние между их центрами. Типичная хроматограмма разделения смеси двух различных веществ представлена на рис. 2.21. Она может быть записана самописцем хроматографа или быть построена по экспериментальным данным.

Количественный состав смеси определяется из допущения, что интенсивность пика каждого компонента пропорциональна его содержанию в смеси. В качестве меры интенсивности принимается площадь пиков. Существуют разные способы измерения площадей пиков. Наиболее простым из них является умножение высоты пика h (рис. 2.21) на его ширину , измеренную на полувысоте пика: S=h·ω.

Хроматографию можно считать универсальным методом, так как она позволяет разделять смеси практически любых веществ. При этом возможна работа как с макроколичествами, так и с микроколичествами соединений. В зависимости от характера задач различают аналитическую хроматографию (качественную или количественную), когда разделяют малые количества веществ, и препаративную, позволяющую получать концентрации, достаточные для исследовательских работ. В настоящее время возможно применение хроматографии и в промышленном масштабе. Достоинство хроматографии и в том, что она легко поддается автоматизации.

Хроматография имеет большое значение в биологии и медицине. Это объясняется тем, что при исследовании компонентов клетки, производстве лекарственных препаратов во многих случаях требуется предварительное выделение компонентов в чистом виде. Проведение анализов в медицинской практике также включает хроматографическое разделение исходных смесей. Врач, получая данные о результатах качественного определения анализируемых веществ в крови или другой биологической жидкости, имеет реальную возможность правильно оценить результаты лечения, эффективность применяемых методов, установить необходимую длительность проведения операции, перитонеального диализа и хирургических методов детоксикации (гемодиализа, гемосорбции).

Хроматография в газовой фазе позволяет количественно оценить весь клинически значимый спектр стероидов. Разработаны методы определения катехоламинов – адреналина, норадреналина и родственных им соединений, гормонов щитовидной железы, альдостерона и кортизола. Хроматография нашла применение при гигиеническом анализе полимерных материалов; состава выхлопных газов; анализе воздуха в производственных помещениях и операционных палатах; хлор-, азот- и фосфорсодержащих пестицидов; определении загрязнений в промышленных сливах (содержание фреонов, различных кислот и их производных, ароматических соединений – фенола, спиртов, нитрилов и т.д.); для оценки качества пищевых продуктов; для концентрирования и установления природы органических примесей в стоках фармацевтических предприятий.

Технический прогресс сделал возможным создание так называемых метаболических профилей биосред – крови, мочи, слюны, выдыхаемого воздуха. В одном таком образце методами газовой хроматографии анализируется несколько сотен компонентов. Метаболические профили так же индивидуальны, как и отпечатки пальцев, но, в отличие от папиллярных узоров хроматограмма метаболитов человеческого организма несет в себе массу медицинской информации – какие лекарства или продукты получал человек в последнее время, какими микроорганизмами вызвано его заболевание и многое другое.

Быстро прогрессируют и другие инструментальные хроматографические методы, среди которых перспективна жидкостная хроматография, где элюентом служит жидкая фаза. Этот метод позволяет анализировать нелетучие биологические образцы – белки, витамины, нуклеотиды, различные лекарственные средства.