Глава 3. Результаты и их обсуждение
На начальном этапе исследований было изучено влияние синтетического пептида GmPep890 10-12 М, ГК 10-7 М, ЯК 10-6 М на морфометрические показатели проростков тритикале. Как видно из полученных результатов, применение данных веществ, приводило к снижению морфометрических параметров проростков тритикале (рис. 3.1, рис. 3.2). При предобработке проростков пептидом сырая масса надземной части проростков снижалась на 33 % по сравнению с контролем, а масса корней на 27 %. Ингибирующее действие пептида может быть обусловлено запуском сигнальных систем и торможением ростовых процессов проростков. Ингибирующее действие ГК и ЯК проявлялось в меньшей степени. Опрыскивание проростков этими кислотами вызывало уменьшение надземной части проростков на 11 % по сравнению с контролем и не влияло на рост корневой системы.
1 – контроль, 2 – синтетический пептид GmPep890 10-12 М,
3 – ГК 10-7 М, 4 – ЯК 10-6 М.
Рисунок 3.1 – Влияние синтетического пептида, ГК и ЯК на массу надземной части проростков тритикале.
1 –контроль, 2 -синтетический пептид GmPep890 10-12 М, 3 - ГК 10-7 М, 4 – ЯК 10-6 М.
Рисунок 3.2 – Влияние синтетического пептида, ГК и ЯК на массу корней проростков тритикале.
Согласно литературным данным, олигопептиды, а также исследованные нами органические кислоты могут обладать элиситорным действием, а, следовательно, влиять на синтез защитных соединений фенольной природы. Поэтому на следующем этапе нами было изучено влияние данных соединений на накопление растворимых фенольных соединений и ГКК.
Как видно из полученных результатов, применение всех исследованных элиситоров не оказывало существенного влияния на суммарное содержание растворимых фенольных соединений (рис.3.3), однако приводило к увеличению уровня ГКК в листьях тритикале на 29 % по сравнению с контролем (рис. 3.4).
1 –контроль, 2 -синтетический пептид GmPep890 10-12 М, 3 - ГК 10-7 М, 4 – ЯК 10-6 М.
Рисунок 3.3 – Влияние синтетического пептида, ГК и ЯК на содержание фенольных соединений в проростков тритикале.
1 –контроль, 2 -синтетический пептид GmPep890 10-12 М, 3 - ГК 10-7 М, 4 – ЯК 10-6 М.
Рисунок 3.4 – Влияние синтетического пептида, ГК и ЯК на содержание ГКК в проростков тритикале.
Анализируя полученные данные, можно заключить, что применение исследованных элиситоров приводит к незначительному ингибированию морфометрических показателей проростков тритикале и модификации биосинтеза вторичных метаболитов фенольной природы. Хотя под действием исследованных соединений суммарное содержание фенолов не претерпевает существенных изменений, но наблюдается увеличение количества гидроксикоричных кислот, играющих важную роль в защите растений от фитопатогенов. Представленные результаты позволяют предположить, что пептидный элиситор GmPep890, а также глутаминовая и янтарная кислоты обладают элиситорными свойствами и могут влиять на устойчивость растений к действию стрессовых факторов. Поэтому на следующем этапе нами было изучено влияние синтетического пептида GmPep890, ГК и ЯК, а также их сочетанное действие на морфометрические характеристики 2-недельных проростков тритикале, подвергнутых оксидативному стрессу. Оксидативный стресс моделировали путем добавления в наружный раствор 10-3МCuCl2, 10-3М Н2О2и 10-3М аскорбиновой кислоты. Медь легко меняет свой окислительно-восстановительный статус, она взаимодействует с аскорбиновой кислотой, переходя в восстановленное состояние, а затем взаимодействует с перекисью водорода, приводя к образованию гидроксильных радикалов. Следовательно, присутствие в наружном растворе данных соединений приводит к развитию окислительного стресса в растениях.
Как видно из полученных результатов, оксидативный стресс приводил к снижению массы надземной части проростков на 24 % по сравнению с контролем (рис. 3.5). Еще в большей степени происходило ингибирование роста корневой системы. Согласно полученным результатам, при стрессовом воздействии масса корней проростков снижалась на 39 % по сравнению с контролем (рис. 3.6). Столь сильный ингибирующий эффект стрессора на морфометрические характеристики проростков, обусловлен активацией окислительных процессов в растениях, вызванных присутствием АФК. Согласно литературным данным, снижение морфометрических характеристик проростков может быть обусловлено активным протеканием в наружном растворе реакции Фентона, при которой образуется гидроксильный радикал, являющийся самым мощным известным окислителем [11].
Как показывают полученные данные, при предварительной обработке (за 24 ч. до действия стресса) проростков синтетическим пептидом GmPep890 не наблюдалось выраженного защитного эффекта как на массу надземной части, так и массу корней. В данном варианте опыта исследуемые параметры снизились более, чем на 30 % по сравнению с контролем и были сравнимы с необработанными растениями, подвергнутыми стрессу. При обработке проростков ГК ингибирующее действие оксидативного стресса оказалось ниже – масса надземной части снизилась на 18%, а масса корней на 26% по сравнению с контролем. Предварительная обработка проростков тритикале ЯК привела к тому, что масса надземной части оказалась сравнимой с контролем, а масса корней снизилась на 26 % по сравнению с контролем.
1 –контроль, 2 – оксидативный стресс без предварительной обработки проростков элиситором, 3 – синтетический пептид GmPep890 10-12 М,
4 – ГК 10-7 М, 5 – ЯК 10-6 М, 6 – сочетанное воздействие пептида GmPep890 и ЯК,7- сочетанное воздействие пептида GmPep890 и ГК.
Рисунок 3.5 – Влияние предобработки растений различными элиситорами на массу надземной части проростков тритикале, подвергнутых действию оксидативного стресса(10-3МCuCl2, 10-3М Н2О2и 10-3М аскорбиновой кислоты) в течение 48 часов.
Кроме того было изучено сочетанное действие композиций пептидного элиситора и органических кислот. Показано, что при предварительной обработке проростков синтетическим пептидом в композиции с ЯК масса надземной части была сравнима с контролем, масса корней снизилась по сравнению с контролем на 16%. При сочетанном действии пептида и ГК масса надземной части снизилась только на 16 %, а масса корней – 20% по сравнению с контролем.
1 –контроль, 2 – оксидативный стресс без предварительной обработки проростков элиситором, 3 – синтетический пептид GmPep890 10-12 М,
4 – ГК 10-7 М, 5 – ЯК 10-6 М, 6 – сочетанное воздействие синтетического пептида и ЯК,7- сочетанное воздействие синтетического пептида и ГК.
Рисунок 3.6 – Влияние предобработки растений различными элиситорами на массу корней проростков тритикале в условиях оксидативного стресса(10-3МCuCl2, 10-3М Н2О2и 10-3М аскорбиновой кислоты) в течение 48 часов.
Анализируя полученные данные, можно заметить, что обработка проростков тритикале чистым синтетическим пептидом GmPep890 не оказала защитного эффекта на морфометрические параметры растений, подвергнутых оксидативному стрессу. Отсутствие защитного действия этого пептида может быть обусловлено его видовой специфичностью. Как известно, данный пептид был выделен из листьев сои и является самым маленьким по размерам пептидным элиситором, найденным к сегодняшнему дню [66]. Показано, что данный пептид осуществляет индукцию защитных генов в растениях сои. Вместе с тем, имеются данные свидетельствующие о том, что соевый пептид не проявляет активности на табаке и арабидопсисе [45]. Следовательно, можно предположить, что активность данного соединения на злаковых культурах также проявляется в значительно меньшей степени по сравнению с бобовыми культурами, к которым и относится соя.
Вызванный защитный эффект применения ГК можно объяснить имеющимися в литературных источниках данными о том, что данная органическая кислота участвует в биосинтезе аминокислоты пролина, который обладает ярко выраженным осморегуляторным и стресс-протекторным действием. Защитный эффект глутаминовой кислоты может быть опосредован ее антиоксидантными свойствами. Как уже упоминалось в первой главе, ГК обладает способностью связывать ионы тяжелых металлов[7,56], а, следовательно, препятствует активному протеканию процессов образования гидроксильного радикала.Кроме того, положительное действие ГК может быть связано с ее участием в процессахнакопления азота, приводящих к росту вегетативных органов растений, а также к увеличению количества хлорофилла и усилению фотосинтеза.
Значительно больший защитный эффект по сравнению с применением ГК выявлен при предварительной обработке проростков ЯК. Защитное действие ЯК может быть связано с тем, что ЯК обладает мощным антиоксидантным свойством, так как она принимает активное участие в обезвреживании свободных радикалов. Как показывают литературные данные, ЯК стимулирует рост и повышает урожай растений, способствуя повышению содержания в листьях хлорофилла, а это, в свою очередь, позволяет растению более интенсивно расти и давать больший урожай [27,56].Применение ЯК также способствует повышению содержания в растениях других органических кислот, аскорбиновой кислоты, аминокислот, сахаров [48]. Вероятно, этим и объясняется положительное воздействие обработок препаратами янтарной кислоты на устойчивость и продуктивность сельскохозяйственных растений. Кроме того, янтарная кислота, наряду с яблочной, лимонной и другими кислотами функционирует в цикле Кребса. В литературе имеются данные, что данные кислоты, введенные экзогенно, легко проникают в митохондрии и используются в цикле трикарбоновых кислот, как и их эндогенные формы, активируя физиолого-биохимические процессы у растений [27].
Наиболее выраженный защитный эффект на морфометрические параметры проростков тритикале, подвергнутых воздействию оксидативного стресса, обнаружен при предобработке растений композицией пептид GmPep890 в сочетании с ЯК. Несмотря на отсутствие защитного действия чистого пептида, его сочетанное действие с ЯК приводит к усилению адаптации растения к стрессовому воздействию. Согласно данным, представленным в литературе, при совместном применении элиситоров различной химической природы, защитный эффект усиливается по сравнению с применением элиситоров по отдельности [45]. Считается, что одно вещество стимулирует проявление большей степени активности другого вещества. Растение же от сочетанного применения испытывает двойную выгоду, так как, во-первых, у него стимулируются физиологические процессы, а это дает возможность интенсификации ростовых процессов, а во-вторых, повышается устойчивость к неблагоприятным факторам среды.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов выявлено, что предварительная обработка растений композицией пептид GmPep890 в концентрации 10-12 М и янтарная кислота в концентрации 10-6 М оказывает защитное действие на рост и развитие проростков тритикале в условиях воздействия оксидативного стресса.
Свидетельством влияния элиситоров на устойчивость растений к различного рода стрессорам могут служить увеличение накопления в растении ряда вторичных веществ, обладающих защитным действием. Это связано с тем, что элиситоры являются сигнальными веществами и осуществляют запуск сигнальных систем, приводящих к экспрессии защитных генов, и тем самым повышают устойчивость растений к биотическим и абиотическим стрессам. Согласно литературным данным, пептид GmPep890 вызывает активацию генов халконсинтезы и хитиназы в растениях сои. Это приводит к усилению синтеза фенольных соединений, в частности ГКК, являющихся предшественниками лигнина, и флавоноидов, обладающих антиоксидантными свойствами. Поэтому на следующем этапе нами было изучено влияние элиситоров на суммарное содержание фенольных соединений и ГКК в проростках тритикале при воздействии оксидативного стресса.
Как видно из полученных результатов, оксидативный стресс приводил к увеличению содержания вторичных соединений фенольной природы. В условиях действия стрессового фактора в течение 48 часов суммарный уровень растворимых фенольных соединений в листьях тритикале увеличился на 24 % по сравнению с контролем (рис.3.7). Еще в большей степени происходило увеличение содержания ГКК. Согласно полученным данным, при стрессовом воздействии уровень ГКК увеличился на 26% по сравнению с контролем (рис. 3.8). Столь сильное возрастание данных соединений в условиях действия стрессора свидетельствует об участии фенольных соединений в защите клеток от негативного влияния факторов среды. Являясь сильными акцепторами, фенольные соединения проявляют антиоксидантное действие, заключающееся в том, что они связывают ионы тяжелых металлов в устойчивые комплексы, лишая их каталитического действия, а также служат акцепторами образующихся при аутоксидации свободных радикалов и поэтому способны гасить свободнорадикальные цепи. Вторым, не менее важным, аспектом является то, что фенолы выполняют роль защитных барьеров на пути механических, химических, физических факторов среды, а также фитопатогенов [21].
1 –контроль, 2 – оксидативный стресс без предварительной обработки проростков элиситором, 3 – синтетический пептид GmPep890 10-12 М,
4 – ГК 10-7 М, 5 – ЯК 10-6 М, 6 – сочетанное воздействие синтетического пептида и ЯК, 7- сочетанное воздействие синтетического пептида и ГК.
Рисунок 3.7 – Влияние предобработки растений различными элиситорами на содержание растворимых фенольных соединений в проростках тритикале в условиях оксидативного стресса(10-3МCuCl2, 10-3М Н2О2и 10-3М аскорбиновой кислоты) в течение 48 часов.
Как показывают полученные данные, при предварительной обработке (за 24 ч. до действия стресса) проростков синтетическим пептидом уровень фенольных соединений увеличился на 34%, а уровень ГКК увеличился на 38% по сравнению с контролем. При обработке проростков ГК содержание фенольных соединений увеличилось в меньшей степени (на 25%), а уровень ГКК увеличился на 30% по сравнению с контролем. Обработка проростков ЯК привела к увеличению суммарного уровня растворимых фенольных соединений на 38% по сравнению с контролем. В данном варианте опыта наблюдалось значительное увеличение содержания ГКК, на 45% по сравнению с контролем. Следовательно, предварительная обработка проростков элиситорами, такими как синтетический соевый пептид GmPep890, ГК и ЯК стимулирует синтез фенольных соединений, что может свидетельствовать о запуске защитных систем растительного организма. Еще в большей степени влияние элиситоров на синтез фенольных соединений проявляется при их сочетанном воздействии. Показано, что при использовании композиции пептида с ЯК суммарное содержание фенолов увеличилось на 45%, а содержания ГКК увеличилось на 61% по сравнению с контролем. Композиция пептида с ГК вызвала меньший по величине ответ: суммарный уровень фенольных соединений повысился на 29%, а уровень ГКК на 42% по сравнению с контролем.
1 –контроль, 2 – оксидативный стресс без предварительной обработки проростков элиситором, 3 – синтетический пептид GmPep890 10-12 М,
4 – ГК 10-7 М, 5 – ЯК 10-6 М, 6 – сочетанное воздействие синтетического пептида и ЯК, 7 – сочетанное воздействие синтетического пептида и ГК.
Рисунок 3.8 – Влияние предобработки растений различными элиситорами на содержание ГКК в проростках тритикале в условиях оксидативного стресса(10-3МCuCl2, 10-3М Н2О2и 10-3М аскорбиновой кислоты) в течение 48 часов.
Анализ полученных результатов позволяет заключить, что предварительная обработка проростков тритикале пептидным соевым элиситором, а также его композициями с ГК и ЯК приводит к значительному накоплению суммарного содержания растворимых фенольных соединений, а также ГКК в листьях растений, подвергнутых оксидативному стрессу. Это свидетельствует об индукции защитных механизмов, в частности, синтезу веществ фенольной природы, позволяющих растению адаптироваться к стрессовому воздействию. Наибольшее накопление фенолов выявлено при обработке проростков тритикале композицией синтетического пептида GmPep890 с ЯК. Как было показано ранее, именно эта композиция оказывала наибольший защитный эффект на морфометрические показатели проростков, подвергнутых оксидативному стрессу.
На основании полученных результатов, а также литературных данных можно предположить воздействие элиситоров на физиолого-биохимические характеристики проростков тритикале в условиях воздействия оксидативного стресса. При экзогенной обработке растений данными препаратами, они воспринимаются как сигнальные вещества, и в растительном организме происходит запуск антистрессовых программ, приводящих к увеличениюсодержания фенольных соединений. Данные вещества выполняют антиоксидантную функцию, приводя к снижению скорости окислительных процессов, и ряд других функций, связанных с регуляцией роста и развития. В конечном итоге действие элиситоров приводит к увеличению устойчивости растений к стрессовым воздействиям, которая отражается в стабилизации физиолого-биохимических процессов.