1.4 Антиоксидантная защитная система растений

Согласно литературным данным, в растительной клетке существует 2 механизма обезвреживания АФК [38]:

1. Ферментативный, представленный работой ферментных систем, обезвреживающих АФК – супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза.

2. Неферментативный, включающий низкомолекулярные антиоксиданты, такие как глутатион, аскорбат, пролин, каротиноиды, токоферол и др.

СОД катализирует диспропорционирование супероксидных-анион радикалов до молекулярного кислорода и пероксида водорода. В клетках растений существуют 3 основные изоформы СОД:

Cu-Zn-СОД – гомодимер (33кДа) в активном центре по 2 атома меди и цинка. Локализация - хлоропласты, митохондрии, пероксисомы, цитоплазма, апопласт.

Mn-СОД – гомодимер (46кДа) или гомотетрамер (92кДа) в активном центре содержится 2 или 4 атома марганца. Локализация - митохондрии, пероксисомы.

Fe-СОД – гомодимер (36кДа-46кДа) – в хлоропластах. Содержание варьирует от 1 до 2 атомов железа в активном центре [64].

Механизм действия всех изоформ СОД заключается в последовательном восстановлении и окислении супероксидными-анион радикалами металла активного центра фермента. Поскольку гидроксильные радикалы, синглетный кислород активно окисляют белковые молекулы, специфических ферментов-дезактиваторов данных АФК не существует, уровень их в клетке опосредованно регулируется СОД путем уборки супероксидных радикалов – источника их образования. По этой причине СОД рассматривается учеными как первичная линия защиты от окислительных повреждений, которая обрывает окисление клеточных макромолекул еще на стадии инициирования [3].

Каталаза представляет собой гемовый фермент, состоящий из четырех субъединиц с общей молекулярной массой около 240 кД. Это металлопротеин с гемовым железом в активном центре. В растениях обнаружено 5 изоформ каталаз. Необходимы достаточно высокие концентрации Н₂О₂ для проявления каталитической функции фермента, имеющего невысокое сродство к субстрату и использующего в качестве донора электрона при восстановлении Н₂О₂ до воды и молекулярного кислорода вторую молекулу пероксида. Согласно литературным данным, каталаза может разложить 44000 молекул Н₂О₂ в секунду [32].

Пероксидазы различаются по субстратам окисления и строению активного центра. Это металлопротеин, содержащий железо в гемовой форме. Пероксидаза катализирует окисление перекисью водорода или молекулярным кислородом ароматических аминов, анилина, бензидина, тирозина, триптофана, индола, индолилуксусной кислоты, фенолов и т.д. Источником АФК для работы пероксидазы могут быть также органические гидроперекиси. Наиболее распространена в растениях гваяколовая пероксидаза, участвующая в биосинтезе лигнина. Особое место занимает глутатионпероксидаза, использующая водород сульфгидрильной группы глутатиона для восстановления гидроперекисей липидов в соответствующие спирты и восстановление пероксида водорода до воды [10]. Структурно ферменты данного семейства представляют собой селеносодержащие тетрамеры. В активном центре фермента находится остаток аминокислоты селеноцистеина.

Неферментативным антиоксидантным звеном является глутатион, который представляет собой небольшой пептид, состоящий из трех аминокислотных остатков (-Глу, -Цис, -Гли), гамма-глутамилцистеинилглицин. Необычный структурный элемент молекулы – амидная связь, образованная взаимодействием амидной группы цистеина и карбоксильной группы глутаминовой кислоты. Глутатион защищает тиольные группы белков, инактивирует радикальные частицы, разрушает перекисные соединения, реагирует с активными формами кислорода [12]. Он может стабилизировать мембранные структуры, удаляя ацильные перекиси, образующиеся в ходе ПОЛ. При этом восстановленная форма глутатиона GSH превращается в окисленную GS-SG. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента ГР. Глутатион является кофактором ферментов ГП – восстанавливает H₂O₂ до воды при окислении глутатиона. Снижение количества восстановленного глутатиона может наблюдаться в результате недостатка глутатионредуктазы и/или снижения скорости синтеза. Это может приводить к сильным клеточным повреждениям. Уменьшение пула восстановленного глутатиона может свидетельствовать о его окислении до GS-SG катализируемом тяжелыми металлами, либо использовании GSH-пероксидазами в процессе ферментативной регенерации перекисей липидов [4].

Витамин С (аскорбиновая кислота) также является антиоксидантом неферментативного звена и участвует с помощью двух различных механизмов в ингибировании ПОЛ. Во-первых, аскорбат восстанавливает окисленную форму витамина Е и таким образом поддерживает необходимую концентрацию этого антиоксиданта непосредственно в мембранах клеток. Во-вторых, он, будучи водорастворимым витамином и сильным восстановителем, взаимодействует с водорастворимыми активными формами кислорода НО^•, О₂^•-, Н₂О₂, и инактивирует их при этом окисляясь до кислоты МДГА или ДГА[31].Окисленные формы снова превращаются в востановленный аскорбат с помощью редуктаз МДГА и ДГА соответственно. В первом случае используется восстановленный эквивалент НАДФН⁺H⁺, а во втором – глутатион.

Аскорбиновая кислота найдена в хлоропластах, цитозоле, вакуолях и внеклеточных компартментах клетки. По литературным данным, в хлоропластах мезофилла листа находится около 20-40% аскорбата [31]. Там же содержатся все ферменты регенерации восстановленной аскорбиновой кислоты из окисленных форм. Было выявлено, что H₂O₂ обезвреживается в хлоропластах в аскорбат-глутатионовом цикле (Холливела–Асады) при участии аскобатпероксидазы [1,37]. По мнению ученых, аскорбатпероксидазная реакция – это центральный процесс целого цикла реакций, направленного на удаление основных активных форм кислорода в хлоропластах.

Цикл включает в себя следующие ферменты: АП, МДАсР, ДАсР и ГР. Во время работы цикла происходит восстановление H₂O₂ в присутствии аскорбиновой кислоты, которая восстанавливается при окислении глутатиона. Окисленный глутатион восстанавливается при участии НАДФН [19].

Аскорбат-глутатионовый цикл подытоживает целый ряд реакций, которые направлены на фотовосстановление молекулярного кислорода до воды в ФС I электронами, образованными в ФС IIиз воды при ее фотоокислении.

Молекулярный механизм аскорбат-глутатионового цикла включает следующие стадии:

1. Окисление воды вФС II:

2Н₂О 4е^- +О₂+4Н⁺

2. Фотовосстановление молекулярного кислорода до супероксидного анион-радикала в ФС I при псевдоциклическом потоке электронов:

2e^- + 2O₂ 2O₂^-•

3. Реакция дисмутации супероксида до пероксида водорода и молекулярного кислорода, катализируемая СОД:

2O₂^-• + 2 H⁺ O₂+H₂O₂

4. Восстановление пероксида водорода аскорбатом до воды, катализируемое АП:

H₂O₂+2АсК 2Н₂О + 2МДАсК

5. Регенерация окисленной формы аскорбата, МДАсК и/или ДАсК, при работе соответсвующих редуктаз МДАсР и ДАсР за счет восстановленного ферредоксина или НАД (Ф) Н из ФС I, которые в свою очередь восстанавливаются электронами изФС II:

2е^- + 2H⁺ 2ДАсК АсК

Таким образом, в аскорбат-глутатионовый цикл 2 из 4 электронов от фотовосстановления двух молекул воды идут на одновалентное восстановление О₂, а остальные 2 электрона используются при восстановлении окисленного аскорбата [25].

Восстановление дегидроаскорбиновой кислоты происходит с использованием протонов трипептида глутатиона. Окисленный глутатион регенерируется при работе ГР в реакции:

GS-SG + ГР-НАДФН 2GSH+ГР-НАДФ⁺

При восстановлении глутатиона донором электронов служит опять фотосинтетическая НАДФН, образующийся в световых реакциях.

В аскорбат-глутатионовый цикле скорость псевдоциклического потока электронов на молекулярный кислород в ФС1 на несколько порядков ниже, чем протекание реакций дисмутации супероксида, катализируемой СОД, восстановления пероксида водорода до воды, катализируемой АП, и восстановления окисленных аскорбата и глутатиона. Поэтому аскорбат-глутатионовый цикл эффективно уменьшает время жизни фотоиндуцированных АФК – супероксида и пероксида водорода – что позволяет снизить вероятность образования гидроксильных радикалов и их взаимодействие с важнейшими биополимерами хлоропластов, и как следствие – избежать фотоингибирования [25].

Пролин – гетероциклическая аминокислота. У многих растений она накапливается в условиях биотического и абиотического стрессового воздействия. При этом пролин оказывает стабилизирующее действие на мембраны, уменьшает осмотический стресс, защищает белки от денатурации, участвует в передаче стрессового сигнала, регулирует редокс-потенциал клетки. Есть также данные, что он участвует в инактивации свободных радикалов, образуя с ними долгоживущие конъюгаты.

Еще одним важнейшим неферментативным антиоксидантным звеном растений являются каротиноиды. По химической природе каротиноиды относятся к классу тетратерпеноидов. Каротиноиды, благодаря наличию сопряженных двойных связей, могут связывать синглетный кислород и ингибируют образование свободных радикалов, предупреждая их негативное действие на растительный организм. Они обеспечивают защиту от ультрафиолетового излучения, так как могут трансформировать энергию УФ - света в видимый свет, что проявляется в явлении флуоресценции. Выступают в роли антиоксидантов, защищая чувствительные ткани и лабильные соединения от окисления [15,31].

Каротиноиды снимают избыток энергии у возбужденного хлорофилла или синглетного кислорода и рассеивают ее через процесс нерадиационной релаксации в виде тепла. Таким образом, может быть предотвращен окислительный стресс. Они так же каротиноиды могут переносить электроны с радикала и модифицировать его структуру, предотвращая дальнейшее развитие цепной реакции[57,31].

Токоферолы (витамин Е) – важнейшие природные антиоксиданты неферментативного звена. По химической природе токоферолы, как и каротиноиды, относятся к семейству терпеноидов (содержат в своей структуре изопрен). В связи с наличием в молекуле токоферолов длинной боковой изопреновой цепи все они нерастворимы в воде, но хорошо растворяются в жирах и органических растворителях [35].Токоферолы синтезируются только в растительных клетках. Существует несколько изомерных форм токоферолов, но в наибольших количествах содержится α-токоферол. Антирадикальная активность α-ТФ обусловлена наличием в его структуре гидроксильной группы –ОН, присоединенной к ароматическому ядру и экранированной двумя метильными группами. Благодаря наличию в структуре ароматического кольца обобщенной системы π-электронов происходит смещение отрицательного заряда на кислород, результатом чего становится возможным достаточно легкий отрыв атома водорода в гидроксильной группе -ОН с образованием радикальной формы –О* альфа-токоферола. Ослаблению связей водорода с кислородом способствуют также соседние метильные группы, экранирующие гидроксильную группу. Витамин Е отдаёт атом водорода свободному радикалу пероксида липида, восстанавливая его до гидропероксида и таким образом останавливает развитие ПОЛ.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что в растениях существует множество систем, обеспечивающих регуляцию уровня активных форм кислорода в растительной клетке в меняющихся условиях среды. По механизму действия антиоксиданты можно разделить на несколько групп [20]:

1. "мусорщиков", которые очищают растительный организм от всех свободных радикалов, чаще всего восстанавливая их до стабильных неактивных продуктов.

2. "ловушки" - антиоксиданты, которые имеют сродство к какому-то определенному свободнорадикальному продукту (ловушки синглетного кислорода, гидроксил-радикала и т.д.). Ловушки часто используют для уточнения механизмасвободнорадикальной реакции.

3.антиоксиданты, обрывающие цепи - вещества, молекулы которых более реакционноспособны, чем их радикалы. Чаще всего это фенолы, которые легко отдают свои электроны, превращая радикал, с которым они прореагировали, в молекулярный продукт, а сами при этом превращаются в слабый феноксил-радикал, который уже не способен участвовать в продолжении цепной реакции.