БХ-методичка

Алгоритм лабораторной работы.

Провести сравнительный анализ активности холинестеразы в разных образцах сыворотки крови (титрование раствором NaOH).

Принцип метода. Холинестераза катализирует реакцию гидролиза ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты. В крови человека содержится два вида холинестеразы. В сыворотке содержится неспецифическая псевдохолинестераза, которая расщепляет не только ацетилхолин, но и другие эфиры холина. В эритроцитах содержится специфическая, истинная ацетилхолинестераза, которая расщепляет лишь ацетилхолин.

Метод выявления и количественного определения холинестеразы основан на титровании щелочью уксусной кислоты, что высвободилась в процессе гидролиза ацетилхолина. Количество щелочи, что пошла на титрование, является мерой активности фермента.

Ход работы. Берут две пробирки. В первую отмеряют 0,5 мл сыворотки крови № 1, во вторую – 0,5 мл сыворотки крови № 2. Потом в обе пробирки с исследуемыми сыворотками добавляют по 2 мл 2% -го раствора ацетилхолина и инкубируют при 37оС 10 минут. После этого добавляют по 2 капли фенолфталеина и титруют содержание пробирок 0,1 М раствором NaOH к слабо розовой расцветке.

Количество щелочи, которое пошло на титрование, является мерой активности фермента.

Заполняют таблицу:

	Количество 0,1 М NaOH,
Исследуемая	которое пошло на	Вывод
сыворотка	титрование, в мл
№ 1
№ 2

По результатам проведенного эксперимента сделать вывод.

Тема 5. Исследование регуляции ферментативных процессов.

Актуальность темы. Протекание биохимических реакций в организме возможно

только при	условии	присутствия каталитически активных форм		ферментов.
Существует	несколько	путей регуляции	активности ферментов:	изменение

каталитической активности фермента, изменение количества фермента. Благодаря

активации или торможению		активности ферментов	увеличивается или уменьшается
скорость	биохимических	реакций, которые	лежат	в основе	процессов
жизнедеятельности. Нарушение регуляции активности				ферментов	приводит к
развитию патологических процессов в организме человека.

Цель и начальный уровень знаний-умений.

Общая цель: изучить регуляцию ферментативных процессов.

Конкретные цели:

1.Анализировать механизмы регуляции основных метаболических процессов.

2.Анализировать пути и механизмы регуляции ферментативных процессов как

основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях.

Исходный уровень знаний-умений: знать свойства ферментов, их строение, активные центры.

11

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

	Содержание и				Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое	изучение		1.1. В тетрадь протоколов опытов выписать
специфичности, торможения			и	алгоритм лабораторной работы.
активации ферментов.
2. Специфичность		действия		2.1.	Объясните		биологическую значимость
ферментов.				специфичности действия ферментов, чем она
				обусловлена?		Какие		виды	специфичности
				ферментов известны Вам? Приведите примеры.
3.		Регуляция		3.1. Регуляция активности ферментов путем
ферментативных процессов.				изменения		каталитической				активности
				фермента:
				а) алостерическая регуляция активности
				ферментов;
				б) ковалентная модификация ферментов;
				в)	активация			ферментов		путем
				ограниченного протеолиза;
				г)	действие		регуляторных			белков-
				эффекторов		(кальмодулина,				протеиназ,
				протеиназных		ингибиторов,			циклических
				нуклеотидов).
				3.2. Регуляция активности ферментов путем
				изменения количества фермента.
4.	Ингибиторы, активаторы			4.1.	Обратимое			и	необратимое
ферментов.				ингибирование ферментов.
				4.2. Физиологически активные соединения и
				ксенобиотики как обратимые (конкурентные и
				неконкурентные) и необратимые ингибиторы
				ферментов.
5.	Изоферменты		–	5.1.	На		примере		изоферментов
множественные молекулярныелактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинфосфокиназы
формы	белков,	результатобъясните значение их определения в клинике.
экспрессии разных генов.				5.2. Проферменты, их биологическая роль и
				значение.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Подготовить реферативное сообщение на тему: “Протеиназы. Протеиназные ингибиторы”.

Алгоритм лабораторной работы.

1. Специфичность ферментов.

Слюну развести в 5 раз ( 1 мл слюны + 4 мл воды). В 2 пробирки налить по 5 кап. разведенной слюны. В первую пробирку добавить 10 кап. 1% раствора крахмала, во вторую – 10 кап. 1% раствора сахарозы. Обе пробирки поместить на 10 мин. в термостат при температуре 38 0С, после чего выполнить реакцию Фелинга на углеводы.

12

Реакция Фелинга: к 5 кап. исследуемой смеси прибавить 3 кап. раствора Фелинга (CuSO4 + NaOH), подогреть. В присутствии глюкозы или мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.

2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

В 3 пробирки налить по 1 мл слюны, разведенной в 10 раз (1 мл слюны + 9 мл воды). В первую пробирку добавить 1 кап. 1% раствора хлорида натрия, во вторую – 1 кап. 1% раствора сернокислой меди, в третью – 1 кап. воды, потом в каждую пробирку добавить по 5 кап. 1% раствора крахмала, перемешать и оставить при комнатной температуре на 4-5 минут. Провести реакцию на крахмал с реактивом Люголя (КІ3).

Реакция на крахмал: к 5 кап. исследуемой смеси добавить 1 кап. раствора Люголя. В присутствии крахмала появляется синяя окраска.

3. Исследовать влияние фосфакола и ионов кальция на активность холинестеразы.

Принцип метода. Холинестераза катализирует реакцию гидролиза нейромедиатора – ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты. В крови человека содержится два вида холинестеразы. В сыворотке содержится неспецифическая псевдохолинестераза, которая расщепляет не только ацетилхолин, но и другие эфиры холина. В эритроцитах содержится специфическая, истинная ацетилхолинестераза, которая расщепляет лишь ацетилхолин.

Фосфорорганические соединения (ФОС, фосфакол) являются необратимыми ингибиторами холинестеразы и ацетилхолинестеразы, поскольку ковалентно связываются с активным центром фермента и тормозят его активность. Препараты ФОС являются высокотоксичными ядами для насекомых (пестициды) и теплокровных животных. Механизм тормозного действия заключается в связывании с ОН-группой серина в активном центре фермента.

Рост концентрации ионов Са2+ в нервном окончание является непосредственным биохимическим сигналом, что активирует выход ацетилхолина через пресинаптическую мембрану, его взаимодействие с холинорецепторами постсинаптической мембраны и расщепления медиатора в синаптической щели ацетилхолинестеразой. Поэтому ионы кальция являются мощным активатором холинестеразы.

Метод количественного определения холинестеразы основан на титровании щелочью уксусной кислоты, что высвободилась в процессе гидролиза ацетилхолина.

Количество щелочи, которое израсходовано на титрование является мерой активности фермента.

Ход работы. Три пробирки заполняют реактивами по таблице.

Содержание пробирок			№ пробирки
	1		2		3
Сыворотка крови, мл	0,5		0,5		0,5
Раствор CaCl2, капель	---		5		---
Раствор фосфакола, капель	---		---		5
Инкубация при комнатной температуре, 5 минут
2%-ной раствор ацетилхолина	1,5		1,5		1,5
Инкубация 10 минут
Фенолфталеин, капель	2		2		2
Количество 0,1 М NaOH,
которое израсходовано на
титрование

По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.

13

Тема 6. Медицинская энзимология.

Актуальность темы.

Уменьшение концентрации или полное отсутствие какого-нибудь фермента в живой системе является результатом генетической неспособности к его биосинтезу и проявляется специфической патологией. В настоящее время известно около 150 таких энзимопатий (в обмене простых и сложных белков, в обмене углеводов, липидов и азотистых оснований).

Изменение активности ферментов в тканях может служить критерием биохимической диагностики, а изучение динамики этих изменений указывает на эффективность лечения.

Чистые ферменты и их смеси широко используются как лекарственные препараты в терапии, хирургии, офтальмологии и других областях медицины.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Объяснить изменения хода ферментативных процессов и накопления промежуточных продуктов метаболизма при врожденных (наследственных) и приобретенных пороках метаболизма – энзимопатиях.

Конкретные цели:

1.Анализировать изменения активности индикаторных ферментов плазмы крови при патологии определенных органов и тканей.

2.Объяснить применение ферментных препаратов и ингибиторов ферментов как фармакологических препаратов при определенных патологических состояниях.

Исходный уровень знаний-умений:

1.Знать строение глутарата, пирувата и α-аминокислот.

2.Знать принцип колориметрии и порядок работы на ФЕК.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке.

	Содержание и			Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое	изучение		1.1. В тетрадь протоколов записать
определения активности АсАТ и АлАТ в			алгоритм лабораторной работы.
сыворотке крови.
2. Медицинская энзимодиагностика.				2.1.	Современные			аспекты
			энзимодиагностики:				клеточные,
			секреторные			та	экскреторные
			ферменты.
				2.2.		Изоферменты		в
			энзимодиагностике,					тканевая
			специфичность			распределения
			ферментов.
				2.3.	Изменение		активности
			ферментов плазмы и сыворотки крови
			как	диагностические			показатели
			развития		патологических		процессов в
			организме.
				2.4. Применение энзимодиагностики
			в	кардиологии,			гепатологии,
			нефрологии,			урологии,	онкологии,
			пульмонологии,			ортопедии,		и тому

14

			подобное (примеры).
3. Энзимопатология.			3.1.	Нарушение			протекания
			ферментативных				процессов:
			наследственные		и	приобретенные
			энзимопатии.
			3.2.	Врожденные				пороки
			метаболизма и их клинико-лабораторное
			исследование.
4.	Энзимотерапия в	медицинской	4.1.	Использование ферментов					в
практике.			качестве лекарственных средств.
			4.2.		Фармакологическое
			применение ферментов				желудочно-
			кишечного тракта; свертываемой и
			фибринолитической			системы		крови,
			каликреин-кининовой				и	ренин-
			ангиотензиновой систем.
5.	Применение	ингибиторов	5.1.	Ингибиторы		ферментов			как
ферментов в медицине.			лекарственные средства.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Подготовить реферативное сообщение по теме:

1.Энзимопатология.

2.Энзимодиагностика заболеваний миокарда, печени.

3.Энзимотерапия.

Алгоритм лабораторной работы.

Количественное определение активности АсАТ и АлАТ в сыворотке крови.

Принцип метода: определяется оптическая плотность раствора гидразона кетоглутарата и пирувата, которые образуются при взаимодействии аланина (или аспартата) с кетоглутаратом. Определение проводят в 1 см кювете при длине волны λ

– 500-530 нм. При определении АсАТ – пируват образуется путем декарбоксилирования оксалоацетата.

Реактивы:

1.Эталонные 2 мМ раствора пирувата.

2.1 мМ раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 1 М НCl.

3.Раствор NаОН (16 ч. в 1000 мл Н2О).

4.Субстрат АсАТ: а) 0,1 мМ раствор аспартата;

б) 0,2 мМ раствор кетоглутарата; в) фосфатный буфер рН-7,4.

5. Субстрат АлАТ: а) 0,2 мМ раствор аланина; б) 0,2 мМ раствор кетоглутарата;

в) фосфатный буфер рН-7,4.

Определение активности АсАТ.

Реактивы,	Опытная проба	Контроль
последовательность
действия
Реактив 4	0,25 мл	0,25 мл
Физраствор	---	0,05 мл
Сыворотка крови	0,05 мл	---
Инкубация до 60 мин.
При t = 23 оС	+	+

15

Реактив 2			0,25 мл	0,25 мл
Перемешиваем		и
оставляем	на 20	мин.	+	+
при t = 23 оС
Раствор щелочи			2,5 мл	2,5 мл

Перемешиваем и через 10 мин. определяем оптическую плотность опытной пробы против контроля в кювете 1см при длине волны λ – 500-530 нм.

Определение активности АлАТ проводят по той же схеме, но вместо реактива 4, берут реактив 5.

Для расчета активности строят калибровачный график с растворами 1 и 2. В сыворотке крови здорового человека активность:

АсАТ = 0,1 – 0,45 мМ / г / л АлАТ = 0,1 – 0,68 мМ / г / л

Тема 7. Исследование роли кофакторов и коферментных витаминов в каталитической активности ферментов.

Актуальность темы.

Ферменты как катализаторы принимают участие во всех без исключения биохимических процессах, которые лежат в основе жизнедеятельности живой материи. Коферменты входят в состав большинства ферментов и практически определяют активность последних.

Коферментные (активные) формы водорастворимых витаминов принимают участие в регуляции жизненно важных биологических процессов, а также находят широкое применение в клинической практике для коррекции нарушений процессов метаболизма.

Цель и исходный уровень знаний-умений.

Общая цель: уметь трактовать биохимические закономерности функционирования витаминов (по их коферментным формам) как компонентов питания человека и регуляторов ферментативных реакций и обменных процессов. Уметь четко исследовать взаимосвязь патогенеза расстройств при разных гиповитаминозах с функционированием определенных звеньев обмена веществ.

Конкретная цель: иметь четкое понятие о биологических функциях водорастворимых коферментных витаминов В2, РР, В6. Уметь писать формулы наиболее важных коферментов, и понимать принципы и цель определения в биологических жидкостях их предшественников.

Исходный уровень знаний-умений. Интерпретировать механизмы участия витаминов в построении коферментов, которые катализируют биохимические реакции в организме (на примере НАД+).

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание			и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое изучение			1.1. В тетрадь протоколов практических
качественных		реакций	на	занятий	выписать алгоритм	лабораторной
витамины В2, РР, В6.				работы.
2.	Небелковая часть сложных			2.1.	Определение	понятия
ферментов.				“коферменты”. Водорастворимые витамины

16

	как	предшественники					в		биосинтезе
	коферментов.
		2.2. Определение понятия “кофакторы”,
	их влияние на структуру и каталитическую
	активность ферментов.
3. Коферменты.		3.1. Строение и свойства коферментов.
		3.2.	Классификация				коферментов			по
	химической природе.
		3.3.	Классификация				коферментов			по
	типу реакции, которая катализуеться:
		а) коферменты, которые являются
	переносчиками				протонов			и	электронов
	водорода;
		б)	коферменты, которые						являются
	переносчиками химических групп;
		в) коферменты синтеза, изомеризации и
	расщепления углерод-углеродных связей.
4. Характеристика и свойства		4.1.	Участие			коферментных форм
коферментных форм витаминов	витаминов			В2	и	РР	в	окислительно-
В2, РР, В6.	восстановительных реакциях.
		4.2.		Влияние				коферментных
	производных			витаминов В6				на	отдельные
	звенья метаболизма.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

1.Создания схемы в электронном варианте по теме “Коферментные витамины”.

2.Написание структурных формул коферментных витаминов и объяснения механизма образования их биологически активных (коферментных) форм.

Алгоритм лабораторной работы.

1) Качественная реакция на витамин B2 .

Принцип метода: реакция на витамин B2 базируется на его способности легко восстанавливаться, при этом раствор B2 желтого цвета, приобретает сначала розовый цвет, а затем обесцвечивается, так как образуется восстановленная форма B2.

Ход работы: к 10 кап. витамина B2 добавляют 5 кап. HCl и железную стружку. Наблюдают выделение пузырей водорода. Раствор постепенно окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается.

2) Качественная реакция на витамин B6 .

Принцип метода: витамин B6 при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета.

Ход работы: к 5 кап. витамина B6 добавляют 5 кап. 1% раствора хлорного железа. Образуется комплекс красного цвета.

Тема 8. Исследование роли кофакторов и коферментных витаминов в каталитической активности ферментов.

Актуальность темы.

Витамины принимают участие в регуляции жизненноважных процессов, в частности, они необходимы для функционирования цикла тpикаpбоновых кислот, биоэнеpгетических процессов и другое. Витамины находят широкое применение в клинической практике для коррекции разных нарушений обмена веществ.

17

Принцип качественных реакций на витамины лежит в основе многих методов определения последних в биологических жидкостях и продуктах питания.

Цель и исходный уровень знаний-умений.

Общая цель.

Уметь применять знание по биохимии для объяснения патогенеза расстройств при витаминной недостаточности, а также их профилактика и обоснования терапии заболеваний, в симптомокомплексе которых имеет место абсолютная или относительная недостаточность витаминов.

Конкретные цели: трактовать роль витаминов и их биологически активных производных в механизмах катализа при участии основных классов ферментов. Анализировать пути и механизмы регуляции ферментативных процессов, как основы обмена веществ в организме в норме и при патологиях.

Исходный уровень знаний-умений. Знать структуру биоорганических соединений, которые входят в состав витаминов.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание

и

Указания к учебным действиям

последовательность действий

1.

Практическое

изучение

1.1. В

тетрадь

протоколов

практических

качественных

реакций

на

занятий выписать

алгоритм

лабораторной

витамины.

работы.

2.

Теоретическое

изучение

2.1. В

тетрадь

самоподготовки

записать

коферментных витаминов.

формулы витаминов, их биологическую роль

и механизм действия.

2.2.

Дать

определение

понятий:

"витамины", "антивитамины", "провитамины"

(условия их превращения в витамины).

Объясните

клиническое

применение

витаминов и антивитаминов на конкретных

примерах.

2.3.

Кофермент

ацетилирования

(Коэнзим-А) – производный пантотеновой

кислоты. Биологические свойства витамина

В3, механизм действия.

2.4.

Коферменты

–

производные

фолиевой кислоты. Витамин Вс (фоллиевая

кислота): биологические свойства, механизм

действия.

2.5. Липоевая кислота: кофермент в

реакциях

окислительного

декарбоксилирования

кетокислот

и

аэробного окисления глюкозы.

2.6.Кофермент тиаминдифосфат.

Витамин В1 (тиамин): строение, биологические свойства, механизм действия.

2.7.Кофермент карбоксибиотин. Витамин

Н(биотин): биологические свойства, механизм действия.

2.8.Коферменты – производные

18

витамина В12. Витамин В12 (кобаламин): биологические свойства, механизм действия.

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Подготовка обзора научной литературы по выбранным темам:

1.Роль витамина С в метаболизме соединительной ткани.

2.Лечебное применение витамина С.

3.Лечебное применение витамина В12.

Алгоритм лабораторной работы. 1) Качественная реакция на витамин B1.

Принцип метода: в щелочной среде тиамин окисляется в тиохpом феppицианид калия. Тиохpом способный флуоресцировать синим цветом при ультрафиолетовом облучении раствора на флуоpоскопе.

Ход работы: к 0,5 мл витаминов добавляют 5 кап. 5% раствора K3Fe(CN)6, 5 кап. 30% раствора NaOH и 15 кап. бутанола (тщательным образом смешать!). Наблюдают синюю флуоресценцию на флуоpоскопе.

2) Количественное определение витамина C в моче.

Принцип метода: метод базируется на способности витамина C восстановливать 2,6-дихлоpфенолиндофенол, который в кислой среде имеет красный цвет, а при восстановлении обесцвечивается.

Ход определения: в колбочку отмеряют 10 мл мочи и 10 мл H2O, добавляют 20 кап. 10% HCl и титруют 0,001н раствором 2,6-дихлоpфенолиндофенолом (ДНФ) до розового цвета.

Расчет:

X = 0,088 А В , где X - содержание витамина C в мг/сут

Б

0,088 - количество витамина C, мг (эмпирическая величина) А - результат титрования, 0,001 н раствором ДНФ, мл Б- объем мочи, взятый для титрования (10 мл)

B - суточный диурез (1500-2000 мл)

Hоpма: 20 - 30 мг/сут.

113,55 - 170,33 мкмоль/сут.

Тема 9. Фундаментальные закономерности обмена веществ. Общие пути превращений белков, углеводов, липидов.

Актуальность темы.

Обмен веществ – один из главных признаков живых организмов. Все виды обмена веществ тесно взаимодействуют между собой. Координацию деятельности всех органов и тканей, основой которой является обмен веществ и энергии, выполняют три важнейшие системы: нервная, эндокринная и сосудистая система. Они осуществляют тонкую регуляцию метаболизма в норме и патологии.

Важно учитывать использование во многих процессах биосинтеза общих источников энергетического обеспечения, существование общих предшественников (например, ацетил-КоА-связующая цепь всех метаболических путей) и общий конечный путь метаболизма (ЦТК, тканевое дыхание).

19

Знание общих закономерностей метаболизма необходимо для глубокого понимания механизмов развития метаболических изменений при многих патологических процессах (например, кетоз при сахарном диабете).

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Усвоить тесную взаимосвязь разных видов обмена веществ и общие механизмы регуляции в норме и при патологии.

Конкретные цели:

1.Анализировать последовательные стадии обмена веществ.

2.Анализировать механизмы регуляции основных метаболических процессов (трех общих стадий).

Исходный уровень знаний-умений: знать строение белков, липидов, углеводов, витаминов, воды, минеральных веществ; строение, свойства и биологическую роль ферментов.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание

и

Указания к учебным действиям

последовательность действий

1.

Метаболические

пути.

1.1.

Катаболизм

как

совокупность

Определить

понятия

процессов

расщепления

биомолекул

катаболические, анаболические и

(глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты до

амфиболические

пути

конечных продуктов).

метаболизма.

1.2. Анаболизм как синтез биомолекул,

необходимых

для построения клеточных

структур.

2.

Экзоергические

и

2.1. Связь катаболизма и анаболизма с

эндоергические реакции.

энергетическим обменом.

2.2. Роль АТФ и других макроэргов в

катаболических

та

анаболических путях

метаболизма.

3.

Три

общие

стадии

3.1. Стадия 1 - распад сложных

катаболизма биомолекул.

макромолекул до простых компонентов.

3.2.

Стадия

2

-

внутриклеточный

катаболизм

углеводов,

липидов

и

аминокислот.

3.3. Ацетил-КоА – общий конечный

продукт

второй

стадии

внутриклеточного

метаболизма

углеводов,

липидов

и

аминокислот.

3.4. Стадия 3 – окисление ацетил-КоА до

конечных продуктов – СО2

и Н2О.

3.5. Общая характеристика ЦТК и

система

транспорта

электронов

в

мембранах

митохондрий

(тканевое

дыхание) и сопряжения с окислительным

фосфорилированием.

4.

Методы

изучения

обмена

4.1.Метод хроматографии, виды, значения.

веществ.

4.2.Метод электрофореза, принцип.

4.3. Метод

дифференцированного

20