БХ-методичка

центрифугирования.

4.4. Метод спектроскопии (ЯМР, рентгеноструктурный анализ).

Практические навыки:

1.Воспроизведение последовательных этапов общих путей катаболизма белков, углеводов и липидов.

2.Объяснить механизмы протекания ферментативных реакций (ферменты и коферменты) на примерах взаимосвязи:

обмен углеводов ↔ обмен белков

↕ ↕

обмен липидов

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Обзор научной литературы по теме:

1.Универсальность хемиосмотической теории для живых систем.

2.Разобщители окислительного фосфорилирования и регуляция термогенеза.

Тема 10. Исследование функционирования цикла трикарбоновых кислот.

Актуальность темы.

Цикл трикарбоновых кислот является общим путем катаболизма органических веществ и важным этапом биологического окисления. Нарушение функционирования цикла трикарбоновых кислот приводит, прежде всего, к гипоэнергетическим состояниям и увеличению альтернативных путей использования ацетил-КоА, в частности кетогенеза.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Изучить биохимические закономерности функционирования цикла трикарбоновых кислот и его регуляцию.

Конкретные цели:

1.Трактовать биохимические закономерности протекания обмена веществ.

2.Трактовать биохимические закономерности функционирования цикла трикарбоновых кислот, его анаплеротических реакций и амфиболитическую роль.

3.Объяснять биохимические механизмы регуляции процессов анаболизма и катаболизма. Объяснять биохимические механизмы регуляции цикла трикарбоновых кислот и его ключевую роль в обмене веществ и энергии.

Исходный уровень знаний-умений: знать строение органических (ди- и трикарбоновых)

кислот.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание	и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1. Практическое изучение		1.1. Записать в тетрадь протоколов-
метода	количественного	опытов алгоритм лабораторной работы.
определения лимонной кислоты.

21

2. Общая характеристика	2.1.Биохимическое	значение	цикла
цикла трикарбоновых кислот.	трикарбоновых кислот.

2.2.Схема функционирования, последовательность реакций.

2.3.Ферментативные реакции цикла трикарбонових кислот: характеристика ферментов.

2.4.Особенности функционирования α-кетоглутаратдегидрогеназного мультиэнзимного комплекса .

2.5.Реакции субстратного фосфорилирования в цикле трикарбоновых кислот.

2.6.Суммарный баланс молекул АТФ, которые образуются при функционировании цикла.

2.7.Анаплеротические и амфиболические реакции цикла трикарбоновых кислот.

3.	Регуляция	цикла 3.1.	Объясните	биохимические
трикарбоновых кислот		механизмы регуляции цикла трикарбоновых
		кислот и его ключевую роль в обмене
		веществ и энергии.

Алгоритм лабораторной работы.

Количественное определение лимонной кислоты.

Принцип метода: метод основывается на реакции взаимодействия лимонной кислоты с солями меди и железа при их одновременном присутствии. Продукты, которые образуются в реакции, имеют желто-зеленый цвет; интенсивность окраски пропорциональна количеству лимонной кислоты.

Ход определения: В пробирку отмеряют 1 мл исследуемой сыворотки, добавляют 7,5 мл воды, а затем 1мл 10% раствора сульфата меди и 0,5 мл 15% раствора железо-амонийнных квасцов в 5% азотной кислоте. Параллельно ставят стандарт: те же реактивы и в той же последовательности, но вместо сыворотки берем 1 мл раствора лимонной кислоты известной концентрации. Содержание пробирок (отдельно) перемешивают и через 5 минут определяют оптическую плотность растворов на ФЭК при синем светофильтре в 5 мм кювете.

По найденным величинами оптической плотности стандарта и сыворотки составляем пропорцию и рассчитываем содержание лимонной кислоты в сыворотке.

В норме концентрация лимонной кислоты в крови 88 - 156 мкмоль/л (1,7 - 3.0 мг%).

Тема 11. Биоэнергетические процессы: биологическое окисление, окислительное фосфорилирование.

Актуальность темы.

Биологическое окисление является конечным этапом распада углеводов, липидов и белков в живых организмах. Оно реализуется мультиэнзимными комплексами внутренних мембран митохондрий, сопровождается поглощением кислорода и выделением СО2, воды и энергии, которая частично аккумулируется в связях АТФ, что синтезируется.

22

Гипоксии, и некоторые естественные и синтетические соединения нарушают биологическое окисление или окислительное фосфорилирование, что приводит к энергетическому кризису и необратимым изменениям в организме.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Знать основы биоэнергетики тканей, механизмы развития энергодефицита и необратимых изменений в организме при гипоэнергетических состояниях.

Конкретные цели:

1.Трактовать роль биологического окисления, тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в генерации АТФ при аэробных условиях.

2.Анализировать нарушение синтеза АТФ при условиях действия на организм человека патогенетических факторов химического, физического и биологического происхождения.

Исходный уровень знаний-умений: знать особенности окислительновосстановительных реакций, уметь объяснить биологическую роль витаминов РР и В2 и ферментов І-го класса в этих реакциях.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание			и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое		изучение	1.1. К какому классу и подклассу
определения			активности	ферментов принадлежат эти ферменты?
цитохромоксидазы митохондрий.				1.2. Записать в тетрадь протоколов-
				опытов алгоритм лабораторной работы и
				объяснит		принцип		метода		определения
				активности цитохромоксидазы митохондрий.
2.	Взаимосвязь		процессов	2.1. Энергия химических связей как
образования и		потребления		основной вид энергии, которая используется
энергии в живых системах.				клетками		для		обеспечения			своей
				жизнедеятельности.
3. Пути синтеза АТФ в				3.1.	Субстратное			и	окислительное
клетках.				фосфорилирование.
				3.2. Образование АТФ в клетках при
				аэробных		и	анаэробных			условиях.
				Преимущества.
4.	Реакции	биологического		4.1. Типы реакций (дегидрогеназная,
окисления.				оксидазная, оксигеназная) их биологическое
				значение.
5. Молекулярная организация				5.1. Компоненты дыхательной цепи как
митохондриальной			цепи	окислительно-восстановительные							пары
биологического окисления.				кофакторов.
				5.2.		Молекулярные				комплексы
				внутренних мембран митохондрий.
6.		Окислительное		6.1.		Освобождение				энергии	в
фосфорилирование.				дыхательной цепи и участки образования
				АТФ.
				6.2.		Коэффициент			окислительного
				фосфорилирования, пункты сопряжения.

23

7.	АТФ-синтетаза	7.1.	Строение	и	принципы
митохондрий.		функционирования АТФ-синтетазы.

Алгоритм лабораторной работы.

Определение активности цитохромоксидазы – компонента дыхательной цепи митохондрий.

Принцип метода. Цитохромы – сложные белки гемпротеины, относятся к классу ферментов – оксидо-редуктаз, собравшиеся во всех животных и растительных клетках. Благодаря тому, что атомы железа в цитохромах легко изменяют свою валентность, цитохромы является компонентами дыхательной цепи митохондрий и переносчиками электронов от восстановленного убихинона на кислород. В цитохромной системе передавать электроны на кислород может лишь цитохром а-а3 – цитохромоксидазы в состав которой входит медь.

Метод определения активности цитохромоксидазы основан на способности диметилпарафенилендиаминхлорида (ДПФД) быть донором электронов для цитохрома с. ДПФД неферментативно восстанавливает цитохром с, а сам окисляясь, превращается в красный пигмент, количественное образование которого является пропорциональным активности цитохромоксидазы митохондрий.

Ход работы. Две пробирки: контрольную и опытную заполняют реактивами по таблице:

Содержание пробирок	Пробирка
	Контрольн	Опытна
	ая	я
Фосфатный буфер, рН = 7,4	1,0 мл	1,0 мл
Раствор цитохрома с	2 капли	2 капли
Суспензия митохондрий	0,5 мл	0,5 мл
Раствор ДПФД	0,5 мл	0,5 мл
Этиловый спирт	1,0 мл	---
Физраствор	---	1,0 мл
Инкубация в термостате 5 мин. при 37оС
Результаты: появление красной окраски

Добавление этилового спирта инактивирует цитохромоксидазу и ферментативное превращение цитохрома с. Пробирки помещают в термостат на 5 минут при 37оС и наблюдают за появлением красной окраски.

По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.

Тема 12. Хемиосмотическая теория окислительного фосфорилирования. Ингибиторы и разобщители окислительного фосфорилирования.

Актуальность темы.

Митохондриальную систему сопряжения окислительных процессов с генерацией высокоэнергетического интермедиата АТФ, называют окислительным фосфорилированием.

Окислительное фосфорилирование позволяет организму поглощать значительную долю потенциально свободной энергии окисления субстратов. Обоснование

24

механизма окислительного фосфорилирования позволяет сделать хемиосмотическая теория. Окислительное фосфорилирование является очень важным процессом, нарушение его протекания несовместимо с жизнью.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Изучить хемиосмотическую теорию окислительного фосфорилирования и условия его эффективного протекания.

Конкретные цели:

1.Трактовать роль биохимического окисления, тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в генерации АТФ при аэробных условиях.

2.Анализировать нарушение синтеза АТФ при условиях действия на организм человека патогенных факторов химического, физического и биологического происхождения.

Исходный уровень знаний-умений: знать особенности гистологического строения митохондрий и основы биоэнергетики тканей.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание				и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое		изучение		1.1. Исследовать процесс окислительного
процесса		окислительного			фосфорилирования		в	митохондриях,
фосфорилирования				в	объяснить, на чем он базируется.
митохондриях.
2.	Хемиосмотическая теория				2.1.	Электрохимический			градиент
окислительного					протонов	(ΔμН+).		Физико-химические
фосфорилирования				–	составляющие электрохимического градиента
молекулярный			механизм		протонов.
генерации АТФ в			процессе
биологического окисления.
3.	Условия	эффективного			3.1.	Целостность		митохондриальной
сопряжения		окисления		и	мембраны.
фосфорилирования				в	3.2. Наличие всех компонентов цепи
митохондриях.					транспорта.
					3.3.	Специфическая		внутримембранная
					топография переносчиков.
					3.4.	Наличие достаточного			количества
					АДФ и Фн.
4. Ингибиторы и разобщители					4.1. Ингибиторы		транспорта		электронов
тканевого дыхания.					(ротинон, амитал, цианиды, СО).
					4.2.	Разобщители		окислительного
					фосфорилирования			(2,4-динитрофенол,
					гормоны щитовидной железы, свободные
					жирные кислоты).
					4.3. Нарушение синтеза АТФ в условиях
					действия на организм человека патогенных
					факторов химического, физического и
					биологического происхождения.

25

Индивидуальная самостоятельная работа студентов.

Обзор научной литературы и подготовка реферативных сообщений по темам:

1.Разобщители окислительного фосфорилирования и регуляция термогенеза.

2.Универсальность хемиосмотической теории для живых систем.

Алгоритм лабораторной работы.

Изучение окислительного фосфорилирования в митохондриях и действие разобщителя– 2,4-динитрофенола на этот процесс.

Принцип метода. В процессе окисления разных субстратов и передачи электронов в дыхательной цепи митохондрий освобождается энергия. Часть этой энергии используется для синтеза АТФ в процессе окислительного фосфорилирования:

АДФ + Фн АТФ В эксперименте, чтобы предотвратить нагромождение АТФ (высокое содержание

АТФ ингибирует ферменты дыхательной цепи) в качестве конечного акцептора неорганического фосфата используют глюкозу. Фосфорилирование глюкозы при участии АТФ катализирует фермент – гексокиназа:

Глюкоза + АТФ АДФ + глюкозо-6-фосфат Определение неорганического фосфата основано на способности молибдата

аммония в кислой среде присоединять остаток фосфорной кислоты с образованием фосфата аммония. Фосфат аммония под действием восстановителя – аскорбиновой кислоты образует продукты окрашенные в синий цвет. В процессе окислительного фосфорилирования Фн изымается из инкубационной среды, и поэтому интенсивность синей расцветки раствора уменьшается.

Разобщители – это соединения которые нарушают сопряженность окисления и фосфорилирования в митохондриях. В присутствии разобщителей наблюдается активное поглощение кислорода митохондриями, однако скорость генерации АТФ – значительно уменьшается (или отсутствует). Согласно хемиосмотической теории, разобщители вызывают потерю мембраной электрохимического протонного потенциала – движущей силы генерации макроэргических связей АТФ.

Материалы и реактивы: свежевыделенные митохондрии из мышц кроля; смесь № 1 – 0,08 моль КН2РО4, 0,255 моль KCl, 0,05 моль MgCl2 растворяют в дистиллированной воде, добавляют 0,1 М раствор КОН к рН = 7,4 и доводят объем в мерной колбе до 1 л; смесь № 2 – водный раствор глюкозы с АТФ, что содержит 90 мг глюкозы и 30 мг АТФ в 1 мл; гексокиназа в 1%-м растворе глюкозы (0,8 мг гексокиназы в 1 мл); 5%-й раствор сукцината калия; 5%-й раствор уксусной кислоты; 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); 1 %-й раствор динитрофенола; 2,5%-й раствор молибдата аммония в 10 М растворе H2SO4 (2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл 20 М раствора H2SO4 и доводят объем водой до 100 мл); 5%-й раствор аскорбиновой кислоты.

Ход работы. Три пробирки – контрольную, опытную № 1 та опытную № 2 заполняют реактивами по таблице:

		Пробирки
Содержание пробирок	Контрол	Опыт		Опыт
	ь	№1		№2
Смесь № 1	1,0 мл	1,0 мл		1,0 мл
Смесь № 2	0,5 мл	0,5 мл		0,5 мл
Гексокиназа	0,5 мл	0,5 мл		0,5 мл
Сукцинат калия	0,5 мл	0,5 мл		0,5 мл

26

2,4-динитнофенол (капли)	---	---		2 капли
Суспензия митохондрий	---	0,5 мл		0,5 мл
Суспензия митохондрий после	0,5 мл	---		---
кипячения
Раствор уксусной кислоты (капли)	2 капли	---		---
Инкубация в термостате 15 мин. при температуре 37оС
Раствор ТХУ	1,0 мл	1,0 мл		1,0 мл
Молибдат аммонию	0,5 мл	0,5 мл		0,5 мл
Аскорбиновая кислота	0,5 мл	0,5 мл		0,5 мл
Результаты: наблюдают за появлением
синей окраски

Уксусная кислота добавляется для полноты денатурации белка в контрольной пробирке. После инкубации в термостате на протяжении 15 мин. при 37оС в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл 10%-го раствора ТХУ; по 0,5 мл 2,5%-го раствора молибдата аммония и по 0,5 мл 5%-го раствора аскорбиновой кислоты. На протяжении 20 минут наблюдают за появлением синей окраски.

По результатам проведенного эксперимента сделать выводы.

Тема 13. Исследование гликолиза – анаэробного окисления глюкозы.

Актуальность темы.

Освобождение энергии солнца, аккумулированной в химических связях глюкозы, начинается при гликолизе в реакции субстpатного окислительного фосфоpилирования. В этом процессе часть энергии глюкозы трансформируется в энергию макроэргических фосфатных связей, которые используются на ресинтез АТФ, то есть форму энергии, доступную для использования всеми тканями при выполнении разных видов работы (синтеза, механической, транспорта веществ через мембраны).

При напряженной работе мышц временно возникают анаэробные условия, и тогда основным процессом, что обеспечивает энергией мышцы, становится гликолиз – анаэробное окисление глюкозы. В норме конечный продукт гликолиза – молочная кислота, - быстро ресинтезируется в печени в глюкозу и гликоген и частично окисляется.

Многие заболевания сопровождаются гипоксией тканей (сердечно-сосудистые заболевания, заболевания легких и др.), что приводит к накоплению в тканях молочной кислоты, развитию ацидоза, и, соответственно, расстройству обмена веществ и функций органов. Определение молочной кислоты в крови является тестом для оценки интенсивности гликолиза. Гиперлактатемия – маркер блока аэробных путей окисления глюкозы.

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Уметь использовать знания о анаэробном обмене углеводов для объяснения состояния организма в норме и при патологии, что сопровождаются гипоксией.

Конкретные цели:

1.Трактовать биохимические закономерности внутриклеточного метаболизма углеводов: анаэробный гликолиз.

2.Уметь писать химизм реакций гликолиза.

27

Исходный уровень знаний-умений: уметь писать строение углеводов (биоорганическая химия): глюкозы, фруктозы. Уметь писать строение спиртов, альдегидов, карбоновых кислот.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание		и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое	изучение	1.1.	Определение		молочной кислоты
метода	определения	молочной	методом Уффельмана.
кислоты.
2.	Анаэробный	гликолиз.	2.1. Общая характеристика анаэробного
Биологическая роль, химизм,			окисления глюкозы.
механизм регуляции.			2.2.	Последовательность			реакций	и
			ферменты гликолиза.
			2.3.	Гликолитическая оксидоредукция:
			субстратное		фосфорилирование			и
			челночные		механизмы		окисления
			гликолитического НАДН. Эффект Пастера.
			2.4. Регуляция гликолиза.
			2.5. Спиртовое и другие виды брожения.
			2.6. Пути утилизации молочной кислоты.
			2.7.	Причины		и	последствия
			гиперлактатемии.

Задание для индивидуальной самостоятельной работы студентов.

1.Написать ферментативные реакции превращения интермедиатов в гликолизе.

2.Построить схему гликолиза.

3.Создать схему регуляции обмена глюкозы.

Алгоритм лабораторной работы.

Определение конечного продукта анаэробного гликолиза – молочной кислоты методом Уффельмана.

Принцип реакции. При взаимодействии комплексного соединения фенолята железа фиолетового цвета с молочной кислотой образуется лактат железа желтозеленого цвета.

Ход работы: помещаем в пробирку 1 мл сыворотки крови, добавляем 5 капель 1% раствора FeCL3 и 1,0 мл раствора фенола. Наблюдаем за появлением желтозеленого цвета.

Тема 14. Исследование аеробного окисления глюкозы.

Актуальность темы.

Аэpобное окисление глюкозы играет важную роль в процессах жизнедеятельности как главный процесс энергообразования (особенно для нервной ткани, сердечной мышцы). При патологии которая сопpовождается гипоксией тканей (инсульт, инфаркт миокарда, облитерирующие заболевания сосудов, заболевания органов дыхания) нарушается аэробный обмен углеводов, это приводит к расстройству других видов обмена веществ и нарушению функций органов и тканей.

28

Цель и исходный уровень знаний.

Общая цель.

Уметь использовать знание об аэpобном окислении глюкозы для объяснения энергетических процессов организма в норме и нарушении их в анаэробных условиях. Уметь использовать в клинике определения ПВК для оценки энергетического обмена человека.

Конкретные цели:

1.Трактовать биохимические закономерности внутриклеточного метаболизма углеводов: аэробное окисление глюкозы.

2.Анализировать изменения уровня ПВК в клинике для оценки энергетического обмена человека и обеспечения витамином В1.

Исходный уровень знаний-умений: уметь писать структуры глюкозы, кетокислот. Знать строение холоферментов и роль коферментов. Знать энергетический обмен.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание			и	Указания к учебным действиям
последовательность действий
1.	Практическое		изучение	1.1.	Определение				пировиноградной
определения		пировиноградной		кислоты в моче.
кислоты	в	биологических
жидкостях.
2.	Изучение		аэробного	2.1.	Этапы		аэробного			окисления
окисления глюкозы.				глюкозы.
				2.2					Окислительное
				декарбоксилирование пирувата.
				2.2.1.			Мультиферментный
				пируватдегидрогеназный						комплекс –
				особенности		функционирования					при
				участии	трех		ферментов			и	пяти
				коферментов.			Суммарное			уравнение
				процесса.
				2.3.	Сравнительная				характеристика
				биоэнергетики		аэробного			и	анаэробного
				окисления глюкозы.
				2.4. Эффект Пастера – переключение из
				анаэробного		на	аэробное			окисление
				глюкозы, особенности регуляции.
				2.5. Челночные механизмы окисления
				гликолитического			НАДН.				Малат-
				аспартатный			шунт			транспорта
				восстановительных						эквивалентов
				гликолитического НАДН в митохондрии в
				аэробных условиях.
3.	Клиническое		значение	3.1.	Причины			и		последствия
определения		пировиноградной		пируватэмии.
кислоты в		биообъектах.

Задание для индивидуальной самостоятельной работы студентов.

29

Подготовить реферат на тему: ”Участие водорастворимых витаминов в углеводном обмене и их клиническое применение”.

Алгоритм лабораторной работы.

Количественное определение пировиноградной кислоты в моче.

Принцип метода: пировиноградная кислота (ПВК) при взаимодействии с 2,4- динитрофенилгидразином (2,4-ДФГ) в щелочной среде образует окрашенный комплекс жѐлто-оранжевого цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональная количеству ПВК.

Ход работы.

(Использовать сухую посуду). В первую пробирку наливают 0,5 мл мочи; во вторую – 0,5 мл стандарта. Потом в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора 2,4- ДФГ; и через 5 минут – по 4 мл концентрированного раствора KOH.

Перемешивают и через 5 минут определяют оптическую плотность (экстинкцию) растворов на ФЕК, в кювете на 5 мм с синим светофильтром. По величинам экстинкций стандарта и опыта рассчитывают содержание ПВК в суточном объеме мочи.

В норме за сутки с мочой выделяется:

10 – 25 мг (114 – 284 мкмоль) ПВК.

Повышение экскреции отмечают при недостатке витамина B1 и гипоксиях разного происхождения.

Тема 15. Альтернативные пути обмена моносахаридов. Метаболизм фруктозы и галактозы.

Актуальность темы.

К альтернативным путям обмена моносахаридов относят пентозофосфатный и глюкуронатный пути обмена глюкозы, обмен фруктозы и галактозы.

Пентозофосфатный путь обмена глюкозы – источник пентоз для синтеза нуклеотидов, нуклеиновых кислот, коферментов, кроме этого является источником восстановленного НАДФН, который используется при синтезе жирных кислот, холестерола, стероидных гормонов и других соединений.

Глюкуронатный путь обмена глюкозы – источник глюкуроновой кислоты, которая используется для синтеза гликозаминогликанов (углеводных производных протеогликанов – белков соединительной ткани) и принимает участие в обезвреживании токсинов в печени.

Фруктоза и галактоза включаются в путь обмена глюкозы. При нарушении превращения фруктозы и галактозы развивается фруктоземия и галактоземия.

Цель и начальный уровень знаний-умений.

Общая цель: изучить альтернативные пути обмена моносахаридов.

Конкретные цели: трактовать биохимические закономерности путей обмена моносахаридов, пентозофосфатный путь окисления глюкозы, путь уроновых кислот.

Исходный уровень знаний-умений: уметь писать строение моносахаридов, гексуроновых кислот.

Ориентировочная карта для самостоятельного изучения студентами учебной литературы при подготовке к занятию.

Содержание и Указания к учебным действиям последовательность действий

30