4. Биомедицинские технологии работа 11. Основы иммунохимических методов исследования на примере реакций агглютинации и преципитации

Вещества, которые стимулируют ту или иную форму специфического иммунного ответа, называются антигенами. Антигенность присуща не только белкам, но и многим сложным полисахаридам, липополисахаридам, полипептидам, а также некоторым искусственным высокополимерным соединениям, т.е. всем веществам, которые могут нести на себе признаки чужеродности.

Чужеродность – неотделимое от антигена понятие. Без чужеродности нет антигена применительно к данному организму. Если взять альбумин кролика, то для этого кролика он не будет антигеном, так как по отношению к данному организму на этом веществе отсутствует отпечаток генетической чужеродности; для морской свинки он будет антигеном, так как для нее он чужероден.

Антигенность – мера антигенного качества, например большая или меньшая способность вызывать образование антител. Если сравнить два белка – бычьи сывороточные альбумин и гамма-глобулин посредством иммунизации ими кролика, то выявится большая антигенность гамма-глобулина: у кролика вырабатывается большее количество антител, которые будут реагировать с этим антигеном.

Иммуногенность – способность создавать иммунитет. Это понятие относится главным образом к микробным антигенам, обеспечивающим создание иммунитета (невосприимчивости) к инфекциям. Например, возбудитель дизентерии обладает высокой антигенностью, но выраженного иммунитета против дизентерии получить не удается. Брюшнотифозная вакцина является и высокоантигенным, и высокоиммуногенным препаратом.

Специфичность – те антигенные особенности, благодаря наличию которых антигены отличаются друг от друга. Существуют вещества, имеющие свой специфический облик, но не вызывающие иммунологических реакций (в частности, выработку антител) при введении в организм. Однако с готовыми антителами они взаимодействуют. Такие вещества получили название гаптенов. Гаптены имеют признаки чужеродности, но не обладают определенными качествами, необходимыми для проявления полноценных антигенных свойств. Гаптены приобретают свойства полноценных антигенов после соединения с крупномолекулярными веществами – белками, полисахаридами или искусственными высокомолекулярными полиэлектролитами. Неантигенные сами по себе липиды и нуклеиновые кислоты могут выступать в роли гаптенов.

Антитела – белки, относящиеся к тому или иному классу иммуноглобулинов, синтез которых стимулируется после парентерального поступления антигена; антитела обладают способностью специфически взаимодействовать с данным антигеном. Известны пять классов иммуноглобулинов: IgM, IgG, IgA, IgE и IgD. Суммарное количество иммуноглобулинов в сыворотке крови составляет около 2,5% (сухой остаток), т.е. более ¹/₃ всех белков. Антитела вырабатываются клетками лимфоидных органов, циркулируют в крови и других жидкостях организма.

Способность реагировать выработкой специфических иммуноглобулинов (антител) присуща не только млекопитающим. У всех обследованных позвоночных обнаружены иммуноглобулины по крайней мере двух классов – IgM и IgG. Филогенетически наиболее ранней формой антител являются, по-видимому, иммуноглобулины класса М. Птицы служат отличными продуцентами антител. Рептилии реагируют антителообразованием весьма слабо: эта способность усиливается при их содержании в условиях повышенных температур (25÷28^оС). Рыбы относятся к последним в филогенетическом смысле организмам, способным, хотя и очень слабо, синтезировать антитела в ответ на введение антигенов.

Сыворотка иммунизированного животного, содержащая антитела, получила название иммунной сыворотки, или антисыворотки.

Феномены взаимодействия антиген – антитело

Реакции специфического взаимодействия сывороточных антител с антигенами, против которых они направлены, проявляются в виде нескольких основных феноменов. Эти феномены легко наблюдать в лабораторных условиях.

Феномен агглютинации заключается в том, что бактерии, животные клетки или другие корпускулярные антигенные частицы, находящиеся во взвеси, под влиянием антител склеиваются между собой. Иначе говоря, если к взвеси бактерий в изотоническом растворе хлорида натрия (реакция идет только в присутствии электролитов) добавить сыворотку иммунизированного этими бактериями животного, то микроскопические элементы взвеси склеиваются между собой и оседают на дно пробирки в виде крупных, различимых невооруженным взглядом хлопьев или зерен. Аналогичное явление происходит и при использовании, например, эритроцитов барана и сыворотки животных, которым вводили эти эритроциты. Склеивание микробов или эритроцитов друг с другом – проявление реакции прямой агглютинации, прямой потому, что в данном случае антитела действуют непосредственно на корпускулярные антигенные частицы.

В лабораториях весьма часто используют не прямую, а пассивную агглютинацию. Этот вариант реакции применяют при работе с растворимыми антигенами, например с альбуминами, полисахаридными антигенами и др. Для получения феномена агглютинации антиген предварительно присоединяют к корпускулярному носителю – таннизированным эритроцитам, частицам латекса, оксида бария и др. Добавление антител к взвеси таких частиц – пассивных носителей антигена, приводит к склеиванию. Реакция пассивной агглютинации характеризуется высокой чувствительностью и пригодна для выявления весьма малых количеств антител.

Количество антител в иммунной сыворотке или в других жидкостях в реакциях агглютинации и многих других реакциях оценивается их титром. Под титром антител понимают то наибольшее разведение сыворотки или иной жидкости, при котором реакция антиген-антитело все еще учитывается. Например, титр антител может быть равен 1:128 или 1:2048. Каждое последующее разведение сыворотки обычно вдвое больше предыдущего (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.).

Феномен преципитации – эффект укрупнения растворимых антигенных субстанций под влиянием антител с возникновением помутнения прозрачных растворов. В этом случае мы сталкиваемся с явлением агрегации растворенных частиц. Следует заметить, что нерастворимый комплекс антиген – антитело выпадает только в определенном диапазоне эквивалентных концентраций реагирующих молекул. В случае большого избытка антител или антигена феномен преципитации не развивается. Это не значит, однако, что взаимодействия реагентов не произошло; оно произошло, но образовался растворимый комплекс антиген – антитело.

Цель работы: Ознакомление с принципами иммунологической специфичности и освоение иммунологических реакций, основанных на феноменах агглютинации и преципитации.

Ход работы

Реакции, основанные на феномене агглютинации

Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек (носителей антигена) друг с другом. В соответствии с этим агглютинирующий эффект иммунной сыворотки может быть выявлен только в том случае, если в реакции используется корпускулярный антиген. При использовании растворимого антигена его необходимо предварительно адсорбировать на инертных носителях.

Реакция агглютинации применяется в двух вариантах:

• метод на плоскости, который позволяет дать быстрый ответ о наличии или отсутствии антител;

• пробирочный метод, который обычно используют для количественного изучения концентрации антител в сыворотке.

Метод на плоскости. На предварительно тщательно вымытую и обезжиренную поверхность предметного стекла наносят 1 каплю сыворотки и 1 каплю взвеси исследуемой культуры клеток в физиологическом растворе (концентрация культуры клеток предварительно подбирается по стандартам мутности). Сыворотку и культуру перемешивают стеклянной палочкой. При покачивании предметного стекла наблюдают появление агглютината, собирающегося в центре. При этом отдельные клетки культуры склеиваются в комочки, т.е. соединяются в более крупные конгломераты, хорошо заметные на фоне прозрачной сыворотки. Агглютинация может наступить быстро, но иногда ее появление отмечается лишь спустя 10÷15 мин. Отрицательный результат фиксируют, если клетки исследуемой культуры остаются равномерно распределенными в смеси и последняя выглядит равномерно мутной.

В качестве контроля на предметное стекло наносят 1 каплю физиологического раствора и 1 каплю исследуемой культуры клеток. Физиологический раствор и культуру перемешивают стеклянной палочкой. В контроле должно наблюдаться отсутствие агглютинации. Контроль ставится для того, чтобы проверить отсутствие спонтанной агглютинации культуры клеток в физиологическом растворе.

Пробирочный метод. В ряд пробирок, за исключением первой, вносят по 0,1 мл физиологического раствора. Затем в первую (пустую) и вторую пробирки помещают по 0,1 мл испытуемой сыворотки. Начиная со второй пробирки, переносят по 0,1 мл смеси сыворотки с физиологическим раствором из каждой предыдущей пробирки в последующую, чем достигается ряд двукратных разведений сыворотки. В контрольную пробирку заливают только физиологический раствор. Затем во все пробирки вносят по 0,1 мл взвеси исследуемой культуры клеток. Пробирки после этого встряхивают и помещают на 30 мин в термостат при 37^оС. Оценка реакции производится макроскопически. При оценке интенсивности реакции агглютинации пользуются следующей схемой.

Резко выраженная агглютинация (+++). Все поле зрения дна пробирки занято единым конгломератом из склеившихся частиц.

Умеренная агглютинация (++). Часть поля зрения дна пробирки занято единым конгломератом склеившихся частиц, часть клеток остается в свободном состоянии, образуя в пробирке некоторую муть.

Слабая агглютинация (+). Среди равномерно распределенных клеток культуры видны мелкие конгломераты из склеившихся частиц.

Отсутствие агглютинации (-). Склеивания частиц не наблюдается.

Реакции, основанные на феномене преципитации.

Реакция кольцепреципитации

Реакция кольцепреципитации впервые предложена Ascoli в 1902 году. Сущность ее заключается в следующем. Сыворотка и антиген наслаиваются друг на друга так, чтобы между ними сохранилась граница раздела фаз. В случае соответствия антигенов антителам иммунной сыворотки происходит их соединение. В результате на границе между слоями этих двух жидкостей появляется видимое невооруженным глазом кольцо преципитации.

Реакция кольцепреципитации является одним из наиболее простых иммунологических методов исследования и применяется для решения самых различных задач. Ее используют наряду с другими методами для оценки титра и специфичности получаемых иммунных сывороток, для определения степени родства антигенов микроорганизмов, антигенов различных видов животных и растений, при изучении вопроса о сроках появления тех или иных антигенов в процессе индивидуального развития организмов, в судебной практике при распознавании характера и видовой принадлежности различных белковых пятен и т.д.

Техника постановки реакции кольцепреципитации

В пробирки диаметром 5÷7 мм разливают по 0,1 мл иммунной сыворотки. На сыворотку с помощью пастеровской пипетки, у которой предварительно конец оттянут в тонкий капилляр, осторожно по стенке пробирки наслаивают равный объем разведений антигена, начиная с меньших его концентраций.

Обязательно должны быть поставлены контрольные опыты. В первом контроле на нормальную (неиммунную) сыворотку наслаивают антиген во всех взятых разведениях, как и в основном опыте. Этот контроль необходим для исключения реакции нормальных антител сыворотки.

Во втором контроле для исключения влияния концентрации соли на образование преципитата на иммунную и нормальную сыворотку наслаивают буферный раствор, в котором разводился антиген. Это может быть физиологический раствор хлористого натрия или какой-либо буферный раствор, например фосфатный, чаще всего со значением pH 7,2÷7,6.

Реакция кольцепреципитации протекает обычно либо при комнатной температуре, либо в термостате (на водяной бане) при 37÷37,5^оС. Результаты оценивают через 10 и 30 мин по титру реакции, т.е. по наибольшему разведению антигена, где наблюдается образование кольца преципитации, а также по интенсивности реакции. В последнем случае учитывается степень плотности кольца преципитации. Интенсивность оценивают по следующей шкале:

• ++++ очень плотное кольцо, оседание хлопьев преципитата на дно пробирки;

• +++ плотное кольцо без оседания преципитата;

• ++ ясно видимое кольцо;

• + слабо выраженное кольцо;

• 0 – отсутствие реакции.

При этом во всех контрольных пробирках реакция должна быть отрицательной.

Реакция преципитации в агаровом геле

Метод диффузионной преципитации в геле позволяет детально изучать состав сложных антигенных смесей, одномоментно определять антигены как общие для ряда тканей, так и специфические только для данной ткани, контролировать эффективность препаративного разделения тканевых антигенов. Но применение этого метода ограничено тем, что с его помощью возможно лишь изучение водорастворимых антигенов и преципитирующих антител.

В основе механизма диффузионной преципитации в геле лежит следующее явление: если при кольцепреципитации, воспроизводимой в жидкой среде, образуется только одно кольцо преципитации независимо от числа вступивших в реакцию пар антиген – антитело, то в геле, где входящие в состав изучаемого экстракта антигены диффундируют навстречу соответствующим антителам с различной скоростью, точки эквивалентных соотношений между различными антигенами и соответствующими антителами располагаются в различных участках геля, где и образуются линии преципитации. Каждая из этих линий, следовательно, соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Таким образом, сложные антигенные системы с помощью этого метода разлагаются на составные части как цвета спектра.

Основные закономерности реакции диффузной преципитации в геле заключаются в следующем:

• один антиген дает только одну полосу преципитации;

• если в растворе присутствует не один, а несколько антигенов, они ведут себя независимо друг от друга;

• количество образующихся зон преципитации соответствует минимуму присутствующих в системе комплексов антиген – антитело;

• путь, пройденный антигеном в геле во время реакции, пропорционален квадратному корню времени диффузии.

Приготовление агара

Для постановки реакции преципитации в агаре необходимо приготовить 1,5% раствор агара. Для этого 1,5 г сухого агара помещают в колбу, туда же добавляют 100 мл физиологического раствора. Колбу помещают на водяную баню и кипятят до полного растворения агара. В растворенный агар добавляют мертиолат в конечном разведении 1:10000.

Метод двойной диффузии в геле по Оухтерлони

В качестве пластинок для реакции применяют хорошо обезжиренные предметные стекла. На стекло ровным слоем разливают горячий агар (2 мл на стекло). Толщина слоя агара на стекле при этом равняется 1 мм. Стекла должны быть абсолютно гладкими, без царапин, и при разливании должны лежать на строго горизонтальной поверхности. В противном случае толщина слоя агара будет неравномерной, что может привести к искажению результатов.

После застывания агара пластинки помещают во влажную камеру. В качестве влажной камеры удобно использовать эксикатор с налитой на дно его водой (в воду следует добавлять антисептик). После застывания агара пластинки по одной вынимают из эксикатора и на поверхности каждой пластинки стандартными штампами выдавливают лунки, из которых затем с помощью водоструйного насоса отсасывают агар. Размеры штампов могут быть различными в зависимости от цели опыта.

В лунки пастеровскими пипетками с тонко оттянутыми концами наливают антигены и антисыворотки и пластинки возвращают в эксикатор. При этом следует иметь в виду, что пластинки с агаром, находясь вне влажной камеры, очень быстро подсыхают. Регистрация результатов реакции осуществляется через сутки после постановки опыта. При диффузии антигенов против антисыворотки в агаре образуются ограниченные зоны, в которых антисыворотки оказываются в оптимальных концентрациях. В этих зонах формируются линии преципитации. Перед постановкой опыта все антигены должны обязательно уравниваться по белку, так как разница в концентрациях антигенов может привести к ошибочным выводам.

Контрольные вопросы

1. Структура антител.

2. Что лежит в основе иммунологической специфичности?

3. В чем заключается феномен агглютинации? Области использования реакций агглютинации в практике.

4. В чем заключается феномен преципитации? Области использования реакций преципитации в практике.