5. Контроль биотехнологических производств работа 13. Основы микробиологического контроля биотехнологических производств

Микробиологический контроль биотехнологических производств является обязательной и важной стадией общего контроля производства и управления технологическим процессом.

Важность микробиологического контроля обусловлена необходимостью обеспечения доминирования промышленного штамма на стадии культивирования и строгой последовательности биосинтетических процессов, гарантирующих эффективность производства целевого продукта высокого качества, а также требованиями создания экологически чистого производства с целью обеспечения безопасности занятого в производстве персонала и охраны окружающей среды.

Микробиологический контроль биотехнологических производств включает несколько компонентов.

1. Микробиологическую характеристику жидкостных и воздушных потоков:

• определение инфицированности входящих потоков;

• определение санитарного состояния производственного оборудования и помещений.

2. Микробиологическую характеристику производственной культуры:

• определение чистоты (отсутствие контаминации) засевной и производственной культуры (при защищенных процессах) или доминирования производственного штамма (при незащищенном процессе);

• определение показателей физиолого-биохимического состояния культуры, определяющих получение целевого продукта требуемого качества.

3. Микробиологическую характеристику качества готового продукта:

• определение общей обсемененности,

• определение живых клеток продуцента.

4. Санитарно-микробиологический контроль:

• состояние рабочей зоны;

• состояние отходящих потоков (воздух, вода) и окружающей среды.

Показатели микробиологического контроля и критерии оценок определяются требованиями технологического регламента и рабочими инструкциями. Методы контроля и допустимые показатели этапа 4 основаны на утвержденных нормах ПДК и содержания техногенных факторов в рабочей зоне (воздухе, рабочих поверхностях и т.п.).

Методы контроля и допустимые показатели по п. 4 основаны на нормах ПДВ и ПДС, утвержденных для каждого предприятия. Методы контроля и требуемые показатели по п. 3 определяются нормативно-техническими документами (технические условия, ГОСТ и др.) на выпускаемый продукт.

Ниже приводится примерная схема микробиологического контроля производства дрожжевой биомассы в незащищенных условиях культивирования. Определение по п. 2 проводится при осуществлении непрерывного процесса культивирования, поскольку в результате протекающих автоселекционных процессов может происходить изменение структуры популяции культивируемого штамма.

При защищенных процессах культивирования (стерильных) контролируется стерильность (т.е. отсутствие контаминации) входящих потоков, отсутствие контаминации засевного материала и готового продукта.

Цель работы: Осуществить микробиологический контроль дрожжевой суспензии, научиться определять доминирование и стерильность производственного штамма дрожжей в культуре на стадии подготовки посевного материала или промышленного культивирования.

Ход работы

Подготовка чашек Петри

В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду (сусло-агар) по 20÷30 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания агара, затем выдерживают 2÷3 сут при 30С крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной.

Выбор разведений для посева

Количество разведений готовят для каждого вида для получения изолированных колоний на поверхности агаризованной среды. Разведения готовят в пробирках с 9 мл стерильной водопроводной воды. Отобранную пробу суспензии тщательно, равномерно размешивают и затем отбирают и переносят пипеткой 1 мл в пробирку с 9 мл стерильной воды (первое разведение 1:10). Суспензию полученного первого разведения необходимо тщательно перемешать с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяют 3÷5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку – это второе разведение – 1:100. Аналогично готовят и последующие разведения.

Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в суспензии и, соответственно, число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходной суспензии или субстрате. Обычно это 5÷8, чаще всего 6 разведений. Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку! Пренебрежение этим простым правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки. Часть клеток, оставшихся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что явится причиной получения завышенного результата.

Для подавления роста бактерий в анализируемую дрожжевую суспензию либо в расплавленный и остуженный до 45С сусло-агар добавляют антибиотики – трептомицин, неомицин (50 ед/мл), тетрациклин, окситетрациклин и хлортетрациклин (0,002÷005 мг/мл).

Посев осуществляют стерильной пипеткой из последних разведений, начиная с самого последнего. После тщательного перемешивания отбирают 0,1 мл суспензии и наносят на поверхность сусло-агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем равномерно распределяют по поверхности среды стерильным шпателем.

Для посевов из разных разведений используют новый стерильный шпатель. Чашки с засевными средами заворачивают в бумагу, предварительно записав на крышках дату посева и кратность разведения, переворачивают вверх дном и помещают в термостат (32÷34С). В качестве контроля проводят посев односуточной культуры производственного штамма дрожжей.

Просмотр выросших колоний осуществляют на 3÷5 сутки. Подсчитывают общее количество дрожжей и грибов. Отдельно определяют количество колоний дрожжей, идентичных производственному штамму, путем сравнения с контрольным посевом, а также количество колоний различных морфологических типов, отличающихся от производственного штамма. Грибная инфекция определяется по процентному отношению колоний грибов к общему числу колоний, выросших на чашке. Колонии дрожжей, сходных с производственным штаммом и отличающихся от него, анализируют по дополнительным тестам.

Дрожжевые варианты, отличающиеся от производственного штамма, относят к посторонним дрожжам.

Результаты анализа записывают в виде дроби

Д/С∙%,

где Д – доминирование производственного штамма в % от общего числа выросших колоний;

С – стабильность производственного штамма в % отношении числа колоний, сходных по морфологии с культурой – продуцентом, к общему числу колоний культуры – продуцента.

Определение общей обсемененности посевом на МПА (мясопептонный агар)

Сущность метода заключается в подсчете колоний, образуемых мезофильными аэробными бактериями при посеве исследуемой суспензии на благоприятной питательной среде и термостатировании при 34С и при 37С – при анализе готового продукта.

Отбор пробы дрожжевой суспензии для анализа осуществляется так же, как описано выше, а для анализа готового продукта в стерильную пробирку шпателем, протертым ватой, смоченной спиртом, с последующим обжиганием на огне, берут навеску продукта массой 1 г. К навеске добавляют 9 мл стерильной водопроводной воды и тщательно перемешивают стерильной палочкой для получения однородной суспензии. Из первого разведения 1:10 готовят последующие разведения – 1:100 и т.д. Порядок разведения выбирают в зависимости от предполагаемой обсемененности продукта, таким образом, чтобы на чашках Петри развивалось от 30 до 300 колоний бактерий.

Приготовление мясопептонного агара осуществляют добавлением 10 г пептона и 5 г хлорида натрия к готовой мясной воде. При выпадении осадка в мясопептонном бульоне необходимо его вторично отфильтровать. В 1 л мясопептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,0÷7,2 и разливают в пробирки, колбы или флаконы. Стерилизуют 20 мин при 120С.

Мясопептоный агар может быть заменен сухим питательным агаром, среду из которого готовят по прописи, прилагаемой к каждой партии сухой среды. При получении каждой новой партии сухого питательного агара необходимо контролировать качество приготовленной из него среды. Если посев на среду, приготовленную из сухого питательного агара, дает неудовлетворительные результаты, то к этой среде добавляют 1/3÷1/4 мясо-пептонного бульона для приближения ее состава к МПА.

Приготовление раствора нистатина

Приготовление осуществляют растворением предварительно растертой в ступке до порошка одной таблетки нистатина в оболочке (медицинский нистатин, упаковка 20 таблеток по 500000 ед) в 100 мл 80% раствора этилового спирта. Полученный раствор нистатина с концентрацией 5000 ед/мл фильтруют.

Подготовка образца к анализу

К дрожжевой суспензии, отобранной из ферментера, добавляют нистатин в концентрации 60÷100 ед/мл для подавления роста дрожжей. Общее количество бактерий в исследуемом образце определяют в 1 мл или 1 г. Разведение для посева выбирают исходя из предполагаемого уровня бактериальной обсемененности. Из каждого приготовленного образца делают посев по 0,1 мл на 2÷3 чашки с заранее маркированным дном (обозначаются дата посева, разведение и шифр образца). Этот объем равномерно распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки Петри переворачивают крышками вниз на 2÷3 сут, помещают в термостат при 34С или 37С (при анализе готового продукта).

Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном (без крышки) на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением в 8÷10 раз. Подсчитанные колонии отмечают точкой на дне чашки с помощью стеклографа или фломастера по стеклу. При большом числе колоний дно чашки Петри расчерчивают на несколько одинаковых секторов, просчитывают число колоний в 2÷3 секторах и среднее число, найденное для одного сектора, умножают на число секторов. Удобен также счет по группам, когда, подсчитав группу колоний не более 20 штук, очерчивают ее и записывают на дне чашки найденное число. Также поступают со всеми соседними группами. Числа, записанные на всех площадках, суммируют. При этом нет надобности заранее расчерчивать дно чашки, размер площадок в зависимости от густоты колоний может быть различным.

Расчет общей обсемененности осуществляют по формуле:

N = Х∙а∙1/n∙V,

где N – количество бактерий в 1 мл (или 1 г) исходной анализируемой пробы;

Х – общее количество подсчитанных колоний при высеве данного разведения;

a – коэффициент разбавления;

n – число повторений;

V – объем суспензии, взятой для посева, мл.

Все отработанные пробирки и колбы с посевным материалом и чашки со средами и отработанными культурами подлежат автоклавированию. Пипетки, предметные стекла и другие виды посуды полностью погружают в 3% раствор хлорамина. После обработки хлорамином посуду кипятят 30 мин, затем промывают холодной водой.

После окончания работы поверхности рабочих столов, внутренние поверхности термостатов обрабатываются 70% этанолом.

Контрольные вопросы

1. Охарактеризуйте структуру микробиологического контроля биотехнологических производств.

2. Какова цель микробиологического и бактериологического контроля биотехнологических производств?

3. Назовите основные методы, используемые при микробиологическом контроле.