Работа 5. Выделение технической рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота

Все ферменты, гидролизующие полинуклеотидные цепи, можно отнести к числу фосфодиэстераз, поскольку они разрушают фосфодиэфирные связи. Они делятся на две группы:

• эндонуклеазы;

• экзонуклеазы.

Эндонуклеазы разрушают связи внутри полинуклеотидной цепи. Под действием этих ферментов цепь распадается на фрагменты, размеры которых могут варьировать от мононуклеотидов до кислоторастворимых полинуклеотидов. Иногда эндонуклеазы называют нуклеодеполимеразами или нуклеофосфодиэстеразами.

Экзонуклеазы расщепляют полинуклеотидную цепь путем последовательного отщепления мононуклеотидов с одного конца цепи. Обычно их называют фосфодиэстеразами.

Экзонуклеазы делятся на две основные группы:

• разрушающие РНК – рибонуклеазы или РНК-азы;

• разрушающие ДНК – дезоксирибонуклеазы или ДНК-азы.

Из различных источников сырья в настоящее время получены разнообразные формы рибонуклеаз, из которых наиболее изучена панкреатическая РНК-аза, т.е. выделенная из поджелудочной железы.

Рибонуклеаза характеризуется устойчивостью в широких пределах рН и значительной термостабильностью в слабокислых растворах, но легко инактивируется щелочами. На ДНК рибонуклеаза не действует. Фермент обладает ярко выраженными антигенными свойствами. Максимальная активность фермента проявляется в области рН от 7,0 до 8,2 с оптимумом при рН 7,7. Температурный оптимум рибонуклеазы – 65^оС.

Действие рибонуклеазы направлено в основном на разрыв связи, соединяющей фосфатный остаток при С-3’ в пиримидиннуклеотиде с С-5’ следующего нуклеотида. Например, нижеприведенный нуклеотид будет разрушаться РНК-азой следующим образом:

фАфЦфУфГфА→фАфЦф+Уф+ГфА.

Поэтому рибонуклеазу можно рассматривать как высокоспецифичную фосфодиэстеразу, гидролизующую только вторичные фосфорные группы пиримидиннуклеозид-3’-фосфаты. Если РНК-аза действует на РНК в течение короткого промежутка времени, то первичными продуктами распада оказываются циклические 2’, 3’-фосфаты цитидина и уридина. Эти циклические фосфаты медленно гидролизуются рибонуклеазой, образуя пиримидин-3’-фосфаты либо в виде свободных нуклеотидов, либо в виде концевых нуклеотидных остатков в олигонуклеотиде.

Получение РНК-азы

Обычно РНК-азу выделяют из свежей бычьей поджелудочной железы путем экстракции 0,25 н серной кислотой при 0÷5^оС. Для очистки от балластных белков в реакционную массу добавляют сернокислый аммоний до концентрации 65%. При этом в осадок переходят трипсиноген, химотрипсиноген и дезоксирибонуклеаза. Затем в фильтрат добавляют сернокислый аммоний до 85% концентрации. При этом в осадок выпадает рибонуклеаза. Полученный фермент можно в дальнейшем очистить перекристаллизацией из этилового спирта.

В данной работе для осаждения РНК-азы используется прием осаждения в изоэлектрической точке (для РНК-азы 8,5÷9,1).

Ход работы

1. 100 г свежей поджелудочной железы быка смешивают с ледяной 0,25 н серной кислотой при 5^оС в соотношении по объему 1:2, т.е. на 100 г железы берут 200 мл 0,25 н серной кислоты и 33,5 мл 96% этанола, который необходим для повышения эффективности фильтрации на последующих стадиях технологического процесса.

2. Суспензию выдерживают при 0÷5^оС в течение 6 ч. Затем суспензию фильтруют через бумажный фильтр. В фильтрате измеряют содержание белка по методу Лоури и активность РНК-азы по методу Кальницкого. Пробу для анализа необходимо развести в 50 раз дистиллированной водой.

3. Полученный фильтрат защелачивают 25% раствором аммиака до рН 7,8÷8,0. Раствор с осадком оставляют на 1 ч в холодильнике.

4. Осадок рибонуклеазы отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин. Измеряют объем надосадочной жидкости. Осадок промывают в центрифужных стаканах 10÷20 мл 96% этанола и высушивают в центрифуге при 2000 об/мин в течение 20 мин.

5. В надосадочной жидкости измеряют активность по методу Кальницкого и содержание белка по методу Лоури. Пробу для анализа необходимо развести в 25 раз дистиллированной водой.

6. Полученный осадок РНК-азы взвешивают на аналитических весах и определяют выход препарата по отношению к массе исходной поджелудочной железы.

7. В 100 мл воды растворяют 10 мг РНК-азы и определяют активность РНК-азы по методу Кальницкого и содержание белковых веществ по методу Лоури.

8. По результатам работы рассчитывают степень осаждения общего белка и степень осаждения рибонуклеазы в изоэлектрической точке:

Х_Р = 1-(с_нж∙V_нж/с_ир∙V_ир);

Х_ИЭТ = 1-(А_нж∙V_нж/А_ир∙V_ир),

где с_нж и с_ир – соответственно концентрации белка в надосадочной жидкости и в исходном растворе, г/л;

А_нж и А_ир – соответственно активность РНК-азы в надосадочной жидкости и в исходном растворе, ед/л;

V_н/о и V_и – соответственно объем надосадочной жидкости и исходного раствора, л.

Контрольные вопросы

1. Роль нуклеиновых кислот в микробной клетке.

2. Пути утилизации нуклеиновых кислот в микробной клетке.

3. Классификация нуклеаз.

4. Отличие между экзо- и эндонуклеазами.

5. Методы очистки ферментных препаратов.