Методы анализа

Определение влажности сухой биомассы

Определение содержания влаги основано на высушивании образца готового продукта в бюксе до постоянной массы в сушильном шкафу при 105С.

Ход анализа

Чистый сухой бюкс предварительно высушивают в сушильном шкафу при 105÷110С в течение 1,0÷1,5 ч с последующим охлаждением в эксикаторе.

Охлажденный бюкс вместе с крышкой вынимают из эксикатора и взвешивают с погрешностью 0,0002 г, затем вносят 1,0÷1,2 г сухой биомассы и взвешивают с той же погрешностью. Открытый бюкс с навеской и крышку помещают в предварительно нагретый до 1052С сушильный шкаф, где выдерживают при этой температуре в течение 1,0÷1,5 ч. Затем бюкс вынимают из сушильного шкафа, закрывают крышкой и переносят в эксикатор для охлаждения.

После охлаждения до 18÷25С бюкс взвешивают и, открыв крышку, ставят в сушильный шкаф для повторного высушивания на 30÷40 мин. По истечении этого времени бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе и взвешивают.

Высушивание считают законченным, если разница между двумя последовательными взвешиваниями составит не боле 0,0004 г. Если разница оказывается большей, то высушивание в течение 30÷40 мин повторяют.

Проводят два параллельных определения, которые при заранее известной точности анализа исключают получение заведомо неверных результатов из-за случайного нарушения методики.

Содержание влаги (W, мас.%) рассчитывают по формуле:

W = [( m₁-m₂)∙100]:(m₁-m ₀),

где m₀ – масса пустого бюкса, г;

m₁ – масса бюкса с навеской биомассы до высушивания, г;

m₂ – масса бюкса с навеской биомассы после высушивания, г.

Определение общего азота методом Къельдаля

Метод Къельдаля позволяет определить аминный и амидный азот. Сущность метода состоит в минерализации дрожжей серной кислотой в присутствии катализаторов до образования сульфата аммония. По количеству азота в полученном сульфате аммония, которое определяют отгонкой аммиака в кислоту, находят содержание сырого протеина. Если дрожжи плохо отмыты, то количество сырого протеина будет завышенным. Для уточнения данных о содержании сырого протеина определяют так называемый истинный белок по Барнштейну или устанавливают коэффициент усвояемости сырого протеина.

Образец – сухую навеску или суспензию – сначала нагревают в присутствии серной кислоты, вызывая окисление органических веществ до углекислого газа и воды. Образующийся аммиак связывается избытком серной кислоты, образуя сульфат аммония. Дальнейшая обработка пробы заключается в выделении свободного аммиака и его количественном определении. К остатку, полученному после сжигания, прибавляют гидроксид натрия. Образовавшийся аммиак отгоняют.

Реактивы:

• кислота серная концентрированная,

• кислота серная, 0,05 н,

• гидроксид натрия, 40%-й раствор,

• селеновый катализатор – смесь 50 г сульфата калия, 5 г сульфата меди и 1 г селена,

• индикатор Конвея – 0,033 г бромкрезолового зеленого и 0,066 г метилового красного растворяют в 100 мл этанола и тщательно перемешивают,

• реактив Конвея – 20 г борной кислоты растворяют в смеси 200 мл этанола и 700 мл дистиллированной воды и добавляют 10 мл индикатора Конвея.

Ход анализа

Точную навеску образца (примерно 0,5 г или 1÷5 мл суспензии) помещают в круглодонную специальную колбу (колбу Къельдаля), добавляют на кончике шпателя небольшое количество селенового катализатора, а затем добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты, на специальной подставке в наклонном положении помещают на электрическую плитку для сжигания пробы. При полном обесцвечивании раствора сжигание заканчивают, колбу остужают, а ее содержимое количественно переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой. После тщательного перемешивания приступают к отгонке аммиака на аппарате Къельдаля. Одновременно со сжиганием пробы проводится определение концентрации абсолютно сухих веществ (АСВ) в пробе.

Непосредственно перед началом перегонки в приемник (коническую колбу вместимостью 50 мл) вносят 10 мл реактива Конвея. В перегонную колбу вливают 10 мл пробы, несколько капель смешанного индикатора. Как только вся проба сольется внутрь перегонной колбы, в нее добавляют 3÷4 мл 40%-го раствора гидроксида натрия до появления зеленоватого окрашивания индикатора, после чего сразу начинается перегонка. Перегонку прекращают, когда рН на выходе из перегонной колбы становится равным 6÷7 (по индикаторной бумаге).

Содержимое приемной колбы титруется 0,05 н раствором серной кислоты при непрерывном перемешивании.

Содержание общего азота рассчитывают по формуле:

W_N = ,

где W_N – содержание азота в пробе;

V – объем серной кислоты, израсходованной на титрование, мл;

0,05 – концентрация титранта, мг-экв/мл;

14 – количество азота, мг, которое связывает 1 мг-экв серной кислоты;

100 – объем раствора в мерной колбе, мл;

10 – количество раствора, взятого для отгона аммиака, мл;

m – навеска материала, мг.

Количество сырого протеина рассчитывают по формуле:

W_{протеин} = N∙6,25,

где 6,25 – эмпирический коэффициент.

Для определения белкового и небелкового азота поступают следующим образом. Навеску 10÷30 мг заливают 5 мл 7% ТХУ (трихлоруксусная кислота) на холоду. Центрифужные пробирки оставляют на ночь в холодильнике, а затем центрифугируют. Надосадочную жидкость переносят в одну колбу Къельдаля, а осадок с небольшой порцией дистиллированной воды – в другую (белковый азот – в осадке, небелковый – в надосадочной жидкости), далее проводят сжигание и отгонку азота по методу Къельдаля.

Метод определения массовой доли белка по Барнштейну

Сущность метода заключается в удалении из продукта водорастворимых небелковых азотсодержащих соединений при обработке продукта горячей водой, восстановлении азота оставшихся органических соединений при минерализации продукта серной кислотой до аммиака, титрометрическом определении аммиака и пересчете его количества на содержание белка по Барнштейну.

В химический стакан отвешивают 0,5÷0,2 г продукта, приливают 100 мл кипящей дистиллированной воды. Стакан ставят на нагреватель и кипятят содержимое 2÷3 мин. Затем стакан снимают и, не охлаждая жидкости, приливают 20 мл раствора сернокислой меди, содержимое перемешивают, добавляют 20 мл раствора гидроксида натрия с массовой долей 2,5%, снова перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 1 ч. Отстоявшуюся жидкость декантируют через фильтр, осадок в стакане промывают горячей водой, декантацией сливая промывные воды, через тот же фильтр. Осадок переносят на фильтр и промывают его горячей водой до исчезновения в промывных водах реакции на сульфат-ион, для чего в пробирку отбирают несколько капель промывных вод и добавляют 2÷3 капли раствора хлорида бария; отсутствие помутнения указывает на полноту промывки.

Промытый осадок вместе с фильтром подсушивают на воздухе или в сушильном шкафу при температуре не выше 105÷107^оС и помещают в колбу Кьельдаля. Испытания проводят одним из установленных способов минерализации (метод Къельдаля).

Метод определения индекса растворимости азота (NSI)

Для определения количества растворенного азота готовят 75 мл 10%-го раствора образца в дистиллированной воде. Полученную суспензию инкубируют в качалке при 30^оС в течение часа. Центрифугированием отделяют осадок, а надосадочную жидкость доводят до 100 мл в мерной колбе и в аликвотной части (5 мл) определяют содержание растворенного азота методом Кьельдаля.

Расчет индекса растворимости азота выполняют по формуле:

NSI = ,

где V – объем серной кислоты, израсходованной на титрование,мл;

0,05 – концентрация титранта, мг-экв/мл;

14 – количество азота, мг, которое связывает 1 мг-экв серной кислоты;

100 – объем раствора в мерной колбе, мл;

10 – количество раствора, взятого для отгона аммиака, мл;

m – навеска материала, мг;

20 – пересчет аликвотной части на весь объем пробы;

W_N – содеражание общего азота в анализируемом образце (определяется методом Къельдаля).

Определение содержания общего жира

Метод основан на экстрагировании органическим растворителем жира из смеси, с последующим гравиметрическим определением его содержания по отношению к исходному образцу.

Ход анализа

Из обезжиренной фильтровальной бумаги сворачивают цилиндрик, в который помещают 2 небольших кусочка обезжиренной ваты и взвешивают. Цилиндрик плотно закручивают с одной стороны и помещают на дно один из кусочков ваты. Затем в цилиндр вносят навеску анализируемого образца массой 3 г, сверху помещают второй кусочек ваты и заворачивают второй конец цилиндра. После чего производят повторное взвешивание, и образец помещают в аппарат Сокслета. Собранный аппарат накрывают асбестовым полотном, заполняют растворителем (этанол:хлороформ=1:2) в количестве 150 мл и нагревают в течение 2÷3 ч с использованием электрической плитки, обеспечивая равномерное кипение растворителя, залитого в колбу. Экстракцию считают законченной через 2 ч.

По окончании аппарат разбирают и переливают растворитель в исходную емкость.

Массовую долю жира во влажном образце W (в %) вычисляют по формуле:

W =

Массовую долю жира в сухом образце W₁ (в %) вычисляют по формуле:

W₁ = ,

где m – навеска анализируемого образца до экстракции, г;

m_о – навеска сухого остатка после экстракции, г;

W_АСБ – содержание сухих веществ в биомассе, %.

Определение содержания нуклеиновых кислот по А.С. Спирину

Метод основан на гидролитическом отщеплении азотистых оснований от молекулы нуклеиновой кислоты при высокой температуре в присутствии хлорной кислоты и последующей спектрофотометрической регистрации отщепленных оснований.

Реактивы:

• хлорная кислота (HClO₄) 1 н.

Ход анализа

2 мл разведенного дистиллированной водой анализируемого раствора помещают в пробирку, в другую пробирку помещают 2 мл дистиллированной воды, затем приливают по 2 мл 1 н HClO₄ и выдерживают в течение 30 мин на водяной бане. Охладив содержимое пробирок, измеряют поглощение против контроля в кварцевых кюветах с толщиной поглощенного слоя 10 мм при 270 и 290 нм на спектрофотометре.

Расчет концентрации нуклеиновых кислот (мг/мл) проводят по формуле:

c_нк = (D₂₇₀ - D₂₉₀)∙а∙2∙54,21,

где D₂₇₀ и D₂₉₀ – поглощение при 270 и 290 нм;

2 – разведение анализируемого раствора при добавлении хлорной кислоты;

а – разведение без учета добавления хлорной кислоты;

54,21 – эмпирический коэффициент;

За окончательный результат принимают среднее арифметическое 3-х параллельных анализов.

Определение «сырой» клетчатки

Для определения суммарных компонентов (клетчатка, гемицеллюлоза, лигнин) наиболее пригоден метод «сырой» клетчатки по Геннесбергу и Штоману. В состав «сырой» клетчатки входят инкрустирующие вещества (лигнин, кутин, суберин), частично гемицеллюлоза, пентозаны, гексозаны и другие вещества. «Сырую» клетчатку получают в результате последовательной обработки навески кислотой и щелочью в точно определенных условиях, в некоторой степени имитирующих действие среды пищеварительного тракта организма. Под действием кислоты из пробы удаляются простые и сложные сахара, некоторые азотистые со­единения. Щелочь омыляет жиры, растворяет белки и часть инкрустирующих веществ.

Ход анализа

Берут навеску клетчатки – 3 г на аналитических весах и помещают в химический стакан на 300 мл, добавляют 200 мл 1,25% раствора серной кислоты и кипятят на сетке в течение 30 мин (время фиксируется с момента закипания). Для поддержания данной концентрации кислоты в стакан регулярно доливают горячую дистиллированную воду до метки (200 мл). Воду подливают сильной струей из промывалки, так чтобы она смывала частицы, приставшие к стенкам стакана. По истечении времени стакан снимают с нагревательного прибора, дают осесть осадку, охлаждают при комнатной температуре. Затем жидкость отсасывают на воронке Бюхнера, после этого осадок несколько раз промывают горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции (проба на универсальную или синюю лакмусовую бумагу).

После промывания осадок вновь переносят с фильтра в тот же химический стакан и добавляют 200 мл 1,25% раствора едкого натра и кипятят 30 мин, регулярно добавляя воду по аналогии с серной кислотой. Затем жидкость отсасывают на воронке Бюхнера, осадок промывают горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции (проба на универсальную или красную лакмусовую бумагу). Только после этого осадок переносят на высушенный и заранее взвешенный на аналитических весах фильтр.

Фильтр должен быть высушен в сушильном шкафу при 100÷150°С в течение 3÷4 ч. Осадок на фильтре промывают смесью спирта и эфира (1:1) для удаления жира. Осадок считается промытым тогда, когда вытекающие капли фильтрата станут бесцветными. Потом осадок вместе с фильтром сушат в сушильном шкафу при 100÷150°С в течение 3÷5 ч.

Осадок после высушивания охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах. По разнице навесок осадка с фильтром и самого фильтра находят массу «сырой» клетчатки и по формуле вычисляют процентное содержание «сырой» клетчатки в пробе (Y), %:

W_cк = 100∙m_cк/m_п,

где m_cк – масса «сырой» клетчатки, г;

m_п – масса пробы, г.

Определение массовой доли свободно извлекаемого жира

Метод основан на растворении липидов в бинарной смеси органических растворителей, их отделении и гравиметрическом определении массовой доли извлекаемого жира.

Ход анализа

Навеску образца массой около 2 г помещают в бумажный цилиндрик, как описано в работе по определению содержания сырого жира. Затем бумажный цилиндирк взвешивают и переносят в делительную воронку, в которую добавляют 20 мл экстрагирующей смеси (этанол:хлороформ=1:2). Проводят экстракцию в течение 2 мин путем переворачивания делительной воронки.

Внимание! Каждые 10 с необходимо открывать кран воронки во избежание возрастания давления за счет испарения растворителя.

Экстракцию повторяют еще два раза с уменьшением объема растворителя до 10 мл. После экстракции бумажный цилиндрик высушивают и взвешивают. Смесь экстрактов переносят в круглодонную предварительно взвешенную колбу и перегонкой регенерируют экстрагент.

Массовую долю жира в образце W_жир (в %) вычисляют по формуле:

W_жир = ,

где m – навеска анализируемого образца до экстракции, г;

m_о – навеска сухого остатка после экстракции, г;

W_АСБ – содержание сухих веществ в биомассе, %.

Определение целлюлозы азотно-спиртовым методом

Для анализа используют азотно-спиртовую смесь, состоя­щую из одного объема концентрированной азотной кислоты (плотностью 1,4 г/мл) и четырех объемов 95%-го этанола.

Ход анализа

Навеску сухой пробы массой около I г помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл и добавляют мерным цилиндром 25 мл азотно-спиртовой смеси. К колбе присоединяют обратный холодильник и кипятят на водяной бане в течение 1 ч. Нельзя допускать слишком бурного кипения во избежание выбрасывания целлюлозной массы в холодильник и разбрасывания по стенкам колбы. После окончания кипячения осадку дают осесть и осторожно сливают жидкость через высушенный до постоянной массы стеклянный, пористый фильтр. Попавшие на фильтр смывают обратно в колбу, используя 25 мл свежей азотно-спиртовой смеси, и снова кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 1 ч. Такую обработку про­водят три-четыре раза. После третьей обработки делают пробу на полноту делигнификации и решают, нужно или нет продолжить обработку. Признаком конца делигнификации служит отсутствие красного окрашивания при действии на пробу целлюлозы (несколько волокон) солянокислого раствора флороглюцина.

После последней обработки целлюлозу отфильтровывают на высушенном до постоянной массы стеклянном пористом фильтре, применяя отсос, промывают 10 мл свежей азотно-спиртовой смеси, а затем горячей водой. При промывке тщательно смывают всю целлюлозу из колбы на фильтр. Отмывку от кислоты проверяют по индикатору метиловому оранжевому, нанося каплю его раствора из капельницы на целлюлозу на фильтре. В присутствии кислоты индикатор принимает красноватый оттенок. В этом случае промывку продолжают. Если индикатор не изменяет цвета, промывку считают законченной. Индикатор смывают горячей водой и тщательно ее отсасывают. Фильтр с целлюлозой сушат в сушильном шкафу при 101÷105°С до постоянной массы и взвешивают.

Массовую долю «сырой» целлюлозы, % к абсолютно сухой пробе, рассчитывают по формуле

W_сц = (m₁-m)∙100/m_АСБ,

где m₁ – масса фильтра с целлюлозой, г;

m – масса пустого фильтра, г;

m_АСБ – масса абсолютно сухой навески вещества, г.

Для расчета массовой доли чистой целлюлозы вносят поправку на остаточные пентозаны. Для этого массовую долю «сырой» целлюлозы умножают на поправочный коэффициент (100-W_п)/100, где W_п – массовая доля остаточных пентозанов в целлюлозе, %. Обычно в целлюлозе умеренной климатической зоны остается 5÷6% пентозанов.

Расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 1,0%.

Определение кислотного числа жиров и масел

Кислотное число (КЧ) – это количество миллиграммов гидроксида калия КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира или масла.

Ход анализа

Коническую колбу взвешивают, после чего вносят жир в количестве 2 г и проводят повторное взвешивание. В колбу добавляют растворитель (этанол:хлороформ=1:2) в количестве 20 мл и 1 мл 1% раствора фенолфталеина в этиловом спирте. Содержимое колбы перемешивают до полного растворения жира и титруют из бюретки 0,1 М раствором КОН до неисчезающей слабо-розовой окраски раствора.

Аналогичное титрование повторяют еще два раза.

Кислотное число (КЧ, мг КОН/г) в образце рассчитывают по формуле:

КЧ = ,

где 561,1 – титр 0,1 М раствора КОН;

V – количество раствора КОН, пошедшее на титрование, мл;

m_н – навеска жира, г;

W_АСБ – массовая доля абсолютно сухого вещества в навеске, %.

Конечным результатом берут среднее арифметическое трех параллельных определений отдельных проб, вычисления проводят до первого десятичного знака.

Определение пероксидного числа жира

Пероксидное число жира выражается количеством граммов йода, выделенного из йодистого калия пероксидами, содержащимися в 100 г жира, или в процентах йода. В то же время пероксидное число дает условную характеристику порчи жира, так как выделяющийся в реакции йодистого калия с пероксидами йод частично расходуется на насыщение альдегидов, ненасыщенных жирных кислот и др.

Определение пероксидного числа основано на том, что при действии пероксидов на йодистый калий выделяется свободный йод, который оттитровывают раствором гипосульфита с индикатором – крахмалом.

I₂+2Na₂S₂O₃=2NaI+Na₂S₄O₆

Ход анализа

Навеску исследуемого жира около 0,5 г, взвешенного с точностью до 0,0001 г, в конической колбе с притертой пробкой расплавляют на водяной бане. В колбу осторожно по стенке вливают 5 мл хлороформа (для растворения образца), а затем 5 мл ледяной уксусной кислоты и 0,5 мл свежеприготовленного насыщенного водного раствора йодистого калия. Колбу закрывают пробкой, а затем вращательными движениями содержимое колбы перемешивают, после чего ставят в темное место на 5 мин. Затем в колбу вливают 50 мл дистиллированной воды и 1 мл 1%-го раствора крахмала, содержимое колбы перемешивают и титруют 0,002 н раствором гипосульфита до исчезновения синей окраски.

Параллельно проводят контрольный опыт (без жира), если его результат превышает 0,05 мл раствора 0,002 н гипосульфита, необходимо приготовить свежие реактивы.

Пероксидное число жира (ПЧ, %) вычисляют по формуле:

ПЧ = K∙(V-V₁) 0,0002538∙100/m,

где К – коэффициент пересчета точно на 0,002 н раствор гипосульфита;

V – количество 0,002 н раствора гипосульфита, израсходованное на титрование исследуемого раствора, мл;

V₁ – количество 0,002 н раствора гипосульфита, израсходованное на титрование контрольного опыта, мл;

0,0002538 – количество йода, соответствующее точно 1 мл 0,002 н раствора гипосульфита, г;

m – навеска жира, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое из трех параллельных определений.

Определение содержания углеводов модифицированным

методом Бертрана

Реактивы:

• раствор Фелинга I: 10 г кристаллогидрата сульфата меди (II) и 0,04 г метиленовой сини растворяют в дистиллированной воде, доводят до 1 л в мерной колбе;

• раствор Фелинга II: 50 г сегнетовой соли, 4 г желтой кровяной соли и 75 г гидроксида натрия растворяют последовательно в дистиллированной воде в фарфоровой чашке, после охлаждения доводят до 1 л.

Ход анализа

В термоустойчивую коническую колбу наливают 5 мл раствора Фелинга I и 5 мл раствора Фелинга II, ставят на нагретую электроплитку и, закрыв колбу часовым стеклышком, доводят содержимое до кипения. Кипящий раствор титруют пробой до перехода фиолетовой окраски в бледно-желтую. Момент, когда окраска пробы станет желтой или желто-зеленой, является концом титрования. Фиксируют объем пробы, пошедший на титрование. Если пробы не хватило, то дотитровку проводят стандартным раствором глюкозы (1 мг/ мл).

Необходимо провести не менее 3-х параллельных определений. Количество анализируемого раствора, пошедшего на титрование, не должно отличаться более чем на 0,1÷0,2 мл. Содержание углеводов в пробе определяют по калибровочной кривой, которую строят с использованием стандартных растворов, соответствующих редуцирующих веществ (глюкоза, фруктоза и т.д.).

Определение содержания редуцирующих олигосахаридов и полисахаридов (метод Бертрана – Шорля)

В случае если анализируемый раствор содержит олиго- и полисахариды, то их определение осуществляют методом Бертрана-Шорля. Метод аналогичен методу Бертрана, но проба предварительно гидролизуется на кипящей водяной бане при определении олигосахаридов – 10 мин, а при определения полисахаридов – 40 мин. Для гидролиза проба смешивается с 2н HCl в соотношении 1:1. Затем проводят определение сахаров методом Бертрана. Калибровочная кривая строится по сахарозе, которая также подвергается предварительному гидролизу.

Метод определения общего содержания углеводов в фенол-серной

реакции (метод Дюбуа)

Реактивы:

• фенольный реактив: 5 г чистого фенола (ч.д.а) растворяют в дистиллированной воде, доводят до 100 мл ( в мерной колбе, под тягой!), затем переносят в темную посуду с притертой крышкой. Раствор хранят в холодильнике;

• концентрированная серная кислота;

• рабочий раствор глюкозы: 1 г глюкозы растворяют в дистиллированной воде, доводят до 100 мл, хранят в холодильнике.

Ход анализа

Анализируемые пробы вносят пипеткой в толстостенные пробирки из пирекса. Объем в каждой пробе доводят дистиллированной водой до 1 мл. Одновременно готовят контрольную пробу с 1 мл дистиллированной воды и серию стандартных растворов глюкозы с концентрацией от 10 до 100 мкг/мл.

Одновременно во все пробирки добавляют по 1 мл фенольного реактива, тщательно перемешивают встряхиванием, а затем добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты, так же быстро перемешивают и оставляют в темном месте для развития окрашивания (Осторожно! При добавлении серной кислоты происходит нагревание, а иногда и разбрызгивание смеси! Работы необходимо производить под тягой!).

Через 15 мин снимают показания оптической плотности при 488 нм против контрольного образца. Строят калибровочную кривую. Концентрацию глюкозы в пробе определяют по стандартной калибровочной кривой. При необходимости учитывают разведение пробы.

Колориметрический метод определения белка по Лоури

Метод основан на образовании окрашенных продуктов синего цвета, образующихся в результате 2-х самостоятельных реакций: биуретовой реакции белка с ионами меди в щелочной среде и реакции восстановления фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой солей реактива Фолина тирозиновыми, триптофановыми и фенилаланиновыми радикалами, присутствующими в испытуемом растворе.

Реактивы:

• Раствор А: 20%-й раствор Na₂CO₃ в 0,1 н NaOH.

• Раствор В: 0,5%-й раствор сульфата меди в 0,1%-м растворе сегнетовой соли.

• Раствор С: смесь 1 объема В и 50 объемов А – готовят перед анализом.

• Реактив Фолина – Чокальтеу.

Ход анализа

В пробирки вносят 0,4 мл анализируемого раствора, затем добавляют 2 мл раствора С, перемешивают и выдерживают 10 мин. После этого вносят 0,2 мл реактива Фолина – Чокальтеу. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выдерживают в темноте 30 мин. Контроль содержит 0,4 мл 0,1 н NaOH и все реактивы. Измеряют оптическую плотность растворов против контроля. Определяют концентрацию белка по калибровочному графику и умножают найденное значение на разведение анализируемого раствора.

Определение массы сухого мицелия гриба на приборе Чижовой

Оборудование:

• прибор Чижовой;

• технические весы;

• пинцет;

• эксикатор;

• бумага.

Ход анализа

Из бумаги вырезают два квадрата со стороной 12 см, складывают их по диагонали, загибают края. Полученные таким образом пакеты помещают на 3 мин между нагретыми до 160С плитами прибора Чижовой. После прогрева пакеты переносят для охлаждения в эксикатор и через 5 мин взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г. В заготовленные пакеты равномерно помещают биомассу гриба, собранную с двух колб, пакеты закладывают в прибор и высушивают в течение 6 мин при 160÷165С. После охлаждения в эксикаторе пакеты с сухим мицелием взвешивают и по разности с массой пустых пакетов определяют массу мицелия, собранного с 200 мл среды, затем пересчитывают на 1 л.

Определения активности рибонуклеазы по Кальницкому

Метод основан на спектрофотометрическом определении кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК.

Реактивы:

• РНК из дрожжей или ее натриевая соль (1%-й раствор в ацетатном буферном растворе).

• Кислота уксусная, 0,1 М раствор.

• Натрий уксуснокислый, 0,1 М раствор.

• Трихлоруксусная кислота, 50%.

• Натрий хлористый, ч.д.а.

• 0,1 М ацетатный буфер с рН 5,0 готовят путем смешивания 29,5 частей 0,1 М раствора уксусной кислоты с 70,5 частями 0,1 М раствора уксуснокислого натрия и добавляют 1,169 г хлорида натрия.

Ход анализа

В опытные центрифужные пробирки вносят по 1 мл исследуемого раствора, а в контрольную – 1 мл ацетатного буферного раствора. Все пробирки помещают в термостат с температурой 370,5^оС на 1÷2 мин. Затем в строгой последовательности в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора субстрата, подогретого до 37^оС. Отсчет времени проводят по секундомеру. После 4-х мин инкубации в каждую пробирку в той же последовательности добавляют по 1 мл 50%-й ТХУ (трихлоруксусной кислоты). Затем все пробирки помещают в ледяную баню на 15 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин.

Из каждой пробирки берут по 0,1 мл центрифугата, разбавляют дистиллированной водой до 3 мл, перемешивают и измеряют оптическую плотность при длине волны 260 нм против дистиллированной воды.

Активность (А) выражают в единицах на мл анализируемого раствора и вычисляют по формуле:

А = (D_а-D_к)∙1000∙30,

где D_а – оптическая плотность анализируемого раствора при 260 нм;

D_к – оптическая плотность контрольного раствора при 260 нм;

30 – коэффициент разбавления супернатанта;

1000 – коэффициент перевода объема из мл в л.

Примечание

При получении значений оптических плотностей, больших 1,0, допускается разведение пробы дистиллированной водой непосредственно перед измерением.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Питательные среды

Минеральный состав среды Чапека

• нитрат натрия – 2,0 г/л,

• гидроортофосфат калия – 1,0 г/л,

• сульфат магния – 0,5 г/л,

• хлорид калия – 0,5 г/л,

• сульфат железа (II) – 0,1 г/л,

• вода водопроводная до 1 л

Среда Ридера

• сульфат аммония – 3,0 г/л,

• сульфат магния – 0,7 г/л,

• хлорид натрия – 0,5 г/л,

• гидроортофосфат калия – 1,0 г/л,

• дигидроортофосфат калия – 0,1 г/л,

• сахароза – 20,0 г/л,

• вода водопроводная до 1 л, рН довести до 5,0.

Минеральный состав среды 9 М

• дигидроортофосфат аммония – 10,0 г /л,

• дигидроортофосфат калия – 10,0 г /л,

• сульфат магния – 0,7 г /л,

• сульфат железа (II) – 0,125 г/л,

• сульфат цинка – 0,125 г/л,

• сульфат марганца (II) – 0,125 г/л,

• хлорид натрия – 0,063 г/л,

• вода водопроводная до 1 л

Минеральный состав среды Эшби

• гидроортофосфат калия – 0,2 г/л,

• сульфат магния – 0,02 г/л,

• хлорид натрия – 0,2 г/л,

• сульфат калия – 0,1 г/л,

• карбонат кальция – 5,0 г/л,

• водопроводная вода до 1 л

Среда для Sacharomyces сегеvisiae

• сульфат аммония – 5,0 г/л,

• дигидроортофосфат калия – 1,0 г/л,

• хлорид калия – 0,15 г/л,

• сульфат магния – 0,20 г/л,

• хлорид кальция – 0,05 г/л,

• дрожжевой автолизат – 50,0 мл,

• маннит или сахароза – 20,0 г/л,

• вода водопроводная до 1 л, рН довести до 6,0.

Среда для разрушения целлюлозы

• гидроортофосфат калия-аммония – 2,0 г/л,

• дигидроортофосфат калия – 1,0 г/л,

• хлорид кальция – 0,3 г/л,

• пептон – 1,0 г/л,

• сульфат магния – 0,5 г/л,

• карбонат кальция – 5,0 г/л,

• водопроводная вода до 1 л

Минеральная среда Рана для жироокисляющих бактерий и грибов

• гидроортофосфат калия – 5,0 г/л,

• хлорид кальция – 1,0 г/ л,

• фосфат аммония – 5,0 г/ л,

• сульфат магния – 1,0 г/ л,

• хлорид натрия – следы,

• хлорид железа (III) – следы,

• водопроводная вода до 1 л

Минеральная основа среды Виноградского

• сульфат аммония – 10, 0 г/л,

• гидроортофосфат калия – 5,0 г/л,

• сульфат магния – 2,5 г/л,

• хлорид натрия – 2,0 г/л,

• сульфат железа (II) – 2,0 г/л,

• карбонат кальция или магния – 20,0 г/л,

• водопроводная вода до 1 л

Среда Гильтая

• цитрат натрия – 2,0 г/л,

• нитрат калия – 1,0 г/л,

• сульфат магния – 1,0 г/л,

• хлорид кальция – 0,2 г/л,

• хлорид железа (III) – следы,

• дигидроортофосфат калия – 1,0 г/л,

• гидроортофосфат калия – 1,0 г/л,

• водопроводная вода до 1 л

Мясопептонный бульон

• пептон – 10,0 г,

• хлорид натрия – 4,0 г,

• мясной бульон до 1,0 л

Смесь микроэлементов по М. В. Федорову

• борная кислота – 5,00 г/л,

• молибдат аммония – 5,00 г/л,

• хлорид калия – 0,50 г/л,

• бромид натрия – 0,52 г/л,

• сульфат цинка шестиводный – 0,20 г/л,

• сульфат алюминия – 0,30 г/л

Универсальный буферный раствор

• NaH₂PO₄ –25 мкрмоль/л;

• H₃BO₃ – 25 мкрмоль/л;

• Лимонная кислота –18 мкрмоль/л;

• NaOH –125 мкрмоль/л,

• рН доводят соляной кислотой или раствором гидроксида натрия.

Дрожжевой автолизат: 200 г прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, добавляют 2,0 г гидроортофосфата натрия, доводят значение рН до 6,1 1 н раствором гидроксида натрия, добавляют 5 мл хлороформа; выдерживают при 37^оС двое суток, доводят до рН 7,4, кипятят 30 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют 30 мин при 115°С.

Дрожжевой экстракт: 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 30 мин при 115°С.

Бобовый отвар: заливают 50 г фасоли (лучше белой) 1 л водопроводной воды и варят до готовности так, чтобы бобы не разварились. Полученный отвар фильтруют через вату, добавляют к нему 10 г сахара и доводят водой до первоначального объема. Устанавливают слабощелочную реакцию среды, разливают в колбы и стерилизуют 30 мин в автоклаве при давлении пара 0,15 МПа.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Биотехнология: учеб. пособие для вузов: в 8 кн./ под ред. Н.С. Егорова и др. – М.: Высш. школа, 1987. – 150 с.

2. Зудин Д.В. Автоматизация биотехнологических исследований/ Д.В. Зудин, В.М. Кантере, В.А. Угодчиков. – М.: Высш. школа, 1987. – 112 с. (обратить внимание на с. 30 – 42, 48 – 75,84 – 92).

3. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот: пер. с англ./ – М.: Мир, 1968. – 333 с.

4. Гауровиц Ф. Химия и функции белков: пер. с англ./ – М.: Мир, 1965. –528 с.

5. Романков П.Г. Массообменные процессы химической технологии (системы с дисперсной твердой фазой)/ П.Г. Романков, В.Ф. Фролов. – Л.: Химия, 1990. – 384 с.

6. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы/ Е.Л. Рубан. – М.: Наука, 1977. – 218 с.

7. Файвишевский М.Л. Производство сухих животных кормов, кормового и технического жиров/ М.Л. Файвишевский. – М.: АО Агропромиздат, 1989. – 189 с.

8. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология/ В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтярев и др. – М.: Высш. школа, 1998. – 416 с.

9. Емельянова И.З. Химико-технологический контроль гидролизных производств/ И.З. Емельянова. – М.: Лесная промышленность, 1976. – 328 с.

10. Холькин Ю.И. Лабораторный практикум по гидролизным производствам/ Ю.И. Холькин, В.М. Скачков. – Л.: Изд-во ЛГУ, 1978. – 86 с.

11. Петров Р.В. Иммунология/ Р.В. Петров. – М.: Медицина, 1983. – 368 с.

12. Лабораторные методы исследования в неинфекционной иммунологии/ под ред. О.Е. Вязова. – М.: Медицина, 1967. – 356 с.

Учебное издание