Часть 2. Культивирование дрожжей на жиросодержащих питательных средах

Цель работы: Ознакомление с процессом глубинного гетерофазного культивирования. Определение основных характеристик роста дрожжей при использовании в качестве субстрата жировых отходов мясокомбинатов.

Сложностью переработки отходов мясопереработки является неоднородность по своему составу образующейся смеси. Необходимо отметить очевидное преимущество микробиологического пути переработки жиросодержащих отходов перед фракционированием, которое заключается в способности микроорганизмов потреблять различные соединения в качестве субстрата в ходе роста, сам процесс протекает в мягких условиях, он менее трудоемок.

Биологические методы очистки, а в последнее время и биоремедиации природных и техногенных сред, принадлежат к числу наиболее крупных и универсальных технологий, широко используемых в различных отраслях промышленной и другой хозяйственной деятельности человека. Они доказали свою эффективность, сравнительную экономичность и экологичность при очистке сточных промышленных и бытовых загрязненных вод и других сред.

В основе микробиологического пути биодеградации жиров лежит способность ряда культур микроорганизмов экскретировать в окружающую среду фермента липазы, который осуществляет катализирование гидролиза липидов. Биодеградация жира и его ассимиляция микроорганизмами начинается с воздействия этого фермента, выделяемого клетками в среду. Липаза представляет собой эстеразу, гидролизующую эфирные связи между кислотой и спиртом, в частности для триглицеридов. Фермент производит гидролитическое расщепление тиацилгилцерола до диацилглицерола и остатка отщепляемой кислоты. Затем идет отщепление следующих остатков карбоновых кислот до образования глицерина. В дальнейшем происходит фосфорилирование глицерина с образованием 1-глицеролфосфата, после чего последний включается в обмен веществ микроорганизмов. В качестве основных путей превращения жирных кислот у микроорганизмов можно выделить β- и ω-окисление.

Ферментативный гидролиз липидов имеет важную особенность: это гетерогенный процесс, так как большинство липаз растворимы в воде, в то время как субстратные молекулы – нерастворимы и объединены в малоподвижные крупные ассоциации (мицеллы, эмульгированные жировые капли). Следовательно, фермент-субстратное взаимодействие должно протекать на границе раздела фаз. Показано, что конформация фермента изменяется при связывании с субстратом, и полипептидный участок, сдвигаясь в сторону, открывает доступ к активному центру. Также установлено, что чем выше степень диспергирования субстрата, тем быстрее идет липолиз. Вероятно, это связано с явлением сорбции фермента и является первым актом ферментативного липолиза.

Среди бактерий найдены активные продуценты липаз, относящиеся к родам Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter, Propionebacterium, Chromobacterium, Alcaligenes. Среди дрожжей лучшими продуцентами являются представители рода Candida (C. lipolytica, C. paralipolytica, C. cylinolraceae). Высокая липазная активность отмечается у грибов родов: Geotrichum, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillium, Oospora, Humicola.

В настоящий момент установлена способность термофильного штамма Candida tropicallis 928 и умеренно галофильного штамма Y. lipolytica использовать жир в качестве углеродного субстрата. Штамм Y. lipolytica рекомендован для очистки сточных вод от жиросодержащих загрязнений в случае предполагаемого использования целевого продукта в качестве кормовой добавки. Активность роста культуры Y. lipolytica существенно различается в зависимости от того, отходы какой технологической стадии используются в качестве субстрата. Наиболее активный рост культуры наблюдается при выращивании ее на смешанной фракции жира. Способность дрожжей использовать жиры нижней фракции гораздо ниже таковой в отношении жиров верхней фракции.

Ход работы

Процесс культивирования осуществляется в лабораторном термостатируемом ферментере (30^оС) общей вместимостью 5 л (рабочий объем – 3,5 л) при непрерывном перемешивании с интенсивностью 250÷280 об/мин и барботировании воздухом (до 300 л/ч). В качестве питательной среды используется минеральная среда Ридера, в которую в качестве источника углерода вносятся жировые отходы мясокомбинатов. Поддержание заданных значений кислотности среды (рН 5,5÷6,0) осуществляется периодической подтитровкой водным раствором аммиака, который одновременно служит и дополнительным источником азота. При запуске ферментации вводится посевной материал в количестве 3÷5% от рабочего объема ферментера.

Определение накопления биомассы

Рост культуры оценивается путем прямого подсчета в камере Горяева. Расчет количества клеток производят по формуле:

N = 0,25∙n ∙а,

где n – среднее количество клеток в 1 большом квадрате;

a – разведение.

Используя коэффициент пересчета, количество клеток (млн/мл) пересчитывают в массовую концентрацию (г/л):

m = 0,03∙N.

Определение потребления компонентов питательной среды

Потребление субстрата оценивается по снижению содержания ионов аммония в питательной среде. Для чего отобранные из ферментера пробы откручиваются в центрифуге при 5 000 об/мин в течение 10 мин. Затем надосадочная жидкость разводится дистиллированной водой в необходимое количество раз таким образом, чтобы раствор содержал от 1 до 4 мкг/мл ионов аммония. Из полученного разведения отбирается 4 мл пробы, к которым добавляют 80 мкл реактива Нестлера и выдерживают в течение 10 мин (строго). Затем определяют светопоглащение на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Содержание ионов аммония рассчитывают следующим образом:

с(NH₄⁺) = D₄₄₀∙8,46,

где D₄₄₀ – оптическая плотность пробы при 440 нм.

Определение изменения липолитической активности культуры

Активность липазы определяют следующим образом. Пробу культуральной жидкости, отобранную из ферментера, откручивают в центрифуге при 5 000 об/мин в течение 10 мин. Затем к реакционной смеси, содержащей 5 мл 40%-й эмульсии оливкого масла в 2%-м поливиниловом спирте, приливают 5 мл надосадочной жидкости. Тест-пробу инкубируют в течение 30 мин при температуре 37^оС, после чего добавляют 10 мл смеси этанол:ацетон (1:1). Степень расщепления оливкового масла определяют, оттитровывая продукты гидролиза раствором гидроокиси натрия (0,05 М NaOH), в присутствии 1 мл 1%-го тимолфталеина, до возникновения голубой окраски. Контрольную пробу обрабатывают аналогично тест-пробе, но не осуществляют инкубирование, то есть после внесения надосадочной жидкости сразу добавляют смесь этанола:ацетон и оттитровывают. Специфическую активность липазы выражают в мкрмоль олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 ч при гидролизе субстрата 1 мг биомассы. Расчет удельной липолитической активности (А_{удельная}), в ед.акт./мг биомассы (по сухому весу), производят по формуле:

А_{удельная} = [(V-V_K)∙K]:[t∙V_E∙с],

где V – количество 0,05 М NaОН, израсходованной на титрование тест-пробы, мл;

V_K – количество 0,05М NaОН, израсходованной на титрование контрольной пробы, мл;

К – количество олеиновой кислоты, оттитровываемое 1 мл 0,05 М NaОН (К=50), мкмоль;

t –­ время реакции, ч;

V_E – объем суспензии клеток, добавляемой к реакционной смеси, мл;

с – концентрация биомассы (по сухому весу), мг/мл.

Расчет общей липолитической активности (А_общая) осуществлялся по формуле:

А_общая = А_{удельная}∙с,

где с – концентрация биомассы в культуральной жидкости, мг/мл.

Перед беседой с преподавателем необходимо составить отчет по следующей схеме:

1. Название работы.

2. Цель работы.

3. Условия процесса культивирования (температура, интенсивность перемешивания, расход воздуха, рН среды).

4. Характеристика посевного материала.

5. Характеристика питательной среды.

6. Все расчеты по частям работы.

7. Сводная таблица:

Отбор проб		Время культивирования	Накопление биомассы		Концентрация ионов аммония, г/л	Липолитическая активность,
дата	время		млн/мл	г/л		Аудельная, ед.акт./мг	Аобщая, ед.акт./мл

8. Графики по накоплению биомассы, потреблению азота (ионов аммония), изменению липолитической активности.

9. Характеристики роста культуры (удельная скорость роста, время генерации, продолжительность основных фаз роста).

10. Выводы.

Техника безопасности при выполнении работы

1. Все растворители ОГНЕОПАСНЫ.

2. Все работы осуществляются строго в резиновых перчатках и под тягой.

Контрольные вопросы

1. Почему жировые отходы целесообразно использовать при культивировании микроорганизмов с целью получения кормового белка?

2. В чем преимущества микробиологической биотрансформации жиросодержащих отходов перед фракционированием и другими путями переработки жиров?

3. Какие трудности могут возникнуть при использовании микробиологического пути переработки жиросодержащих отходов?

4. На каких этапах работы мясоперерабатывающего комбината образуются жиросодержащие отходы?

5. Предложите микроорганизмы, наиболее подходящие для биотрансформации жировых отходов. Ответ обоснуйте.

6. Какой из вариантов культивирования является наиболее подходящим для биоремедиации отходов мясопереработки и почему?

7. Охарактеризуйте особенности глубинного гетерофазного культивирования.

8. Каким образом можно судить об окончании процесса ферментации?