Работа 12. Реакция связывания комплемента

Комплемент – ферментная система, необходимая для осуществления лизиса клеток (гемолиз, бактериолиз и др.) после присоединения к ним специфических антител. Эта система имеется в кровяной сыворотке всех млекопитающих. Особенно активна система комплемента у морской свинки. В классической иммунологии сыворотка морской свинки чаще всего используется в качестве комплемента при постановке реакций бактериолиза или гемолиза. Сыворотка, прогретая при 56^оС в течение 30 мин, лишается комплементарной активности.

Если к свежей сыворотке крови животного, иммунизированного чужеродными эритроцитами, добавить эритроциты этого же животного, то вскоре произойдет их агглютинация, а затем лизис (гемолиз). Гемолиз не произойдет, если эритроциты добавить не к свежей сыворотке, а к сыворотке, предварительно прогретой при 56^оC в течение 30 мин. Однако при добавлении к такой прогретой сыворотке небольшого количества свежей сыворотки любого другого животного, даже относящегося к другому виду, агглютинированные эритроциты немедленно начнут лизироваться. Это явление связано с присутствием в сыворотке крови комплемента, который воздействует не на антиген сам по себе, а на комплекс антиген – антитело. Иначе говоря, специфические антитела как бы подготавливают соответствующий антиген к действию комплемента, сенсибилизируют его.

Система комплемента включает девять различных протеинов (факторов), некоторые из них состоят из комплекса протеиновых субъединиц. Девять основных протеинов обозначают символами С1, С2 и т.д., а полипептидные субъединицы С1 – С1q, C1r, C1s. Вся система представляет собой последовательную цепь ферментов, активация которой инициируется комплексом антиген – антитело. В активации участвуют ионы Ca²⁺ и Mg²⁺. Конечный продукт С9 осуществляет лизис клеток. Последовательность включения отдельных компонентов комплемента такова: антиген – антительный комплекс активизирует С3 компонент комплемента, далее С3С1, С2С3С4, , С5С6С7, С8С9, С9лизис. Основное звено – компонент С3, который относится к ₂-глобулинам, его молекулярная масса около 180000, концентрация в сыворотке крови 1500 мкг/мл.

Инициирующим фактором является комплекс антиген – антитело, поскольку при его образовании молекулы IgM и IgG меняют свою конформацию так, что на Fc-фрагменте обнажается участок, взаимодействующий с компонентом С3 комплемента. В присутствии ионов Ca²⁺ С3 активизируется, активация передается на С1 фактор и включается весь каскад.

Реакция связывания комплемента является одним из наиболее чувствительных иммунологических методов. Поэтому знание природы и свойств комплемента – необходимое условие для тех, кто предполагает проводить иммунологические исследования.

Антитела иммунной сыворотки, вызывающие вместе с комплементом лизис клеток, были названы лизинами. Так как при этой реакции всегда необходимо присутствие комплемента, ее часто называют реакцией связывания комплемента, а антитела – комплементсвязывающими.

Реакция связывания комплемента протекает в две фазы:

• первая фаза – антитело, встретившись с соответствующим антигеном, образует комплекс аниген – антитело;

• вторая фаза – комплекс антиген – антитело адсорбирует из окружающей среды комплемент. При отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом образование комплекса антиген – антитело не имеет места и адсорбции комплемента не происходит. Если в среде содержится только один из компонентов комплекса, адсорбции комплемента также практически не произойдет и последний останется в жидкости.

Для определения наличия в среде свободного комплемента разработана специальная методика, в которой в качестве индикатора используют эритроциты, сенсибилизированные соответствующим антигеном – гемолизином (гемолитическая система). При наличии в среде свободного комплемента обработанные гемолизином эритроциты подвергаются легко наблюдаемому невооруженным глазом гемолизу. При отсутствии комплемента в среде взвесь сенсибилизированных эритроцитов сохраняет свой первоначальный вид

Реакция связывания комплемента может быть использована с диагностической целью:

• если в руках исследователя имеется специфический антиген, можно определить в исследуемом материале (крови) присутствие специфического к нему антитела и на этом основании поставить диагноз;

• если в распоряжении исследователя имеются специфические антитела (иммунные сыворотки), можно определить характер изучаемого антигена.

Реакция связывания комплемента может быть также использована для оценки титра и специфичности получаемых на животных иммунных сывороток, для изучения антигенной структуры различных тканей и органов, в исследованиях, посвященных сравнительному изучению антигенных свойств тканей различных животных и человека, и т.д.

Цель работы: Ознакомление с одной из ферментных систем неспецифической защиты организма – системой комплемента, освоение реакции связывания комплемента.

Ход работы

Реакция связывания комплемента является высокочувствительным методом исследования, позволяющим выявлять очень незначительные количества антигенов и антител. Метод предполагает следующую последовательность этапов постановки опыта:

• приготовление гемолитической системы,

• титрование комплемента для определения его рабочей дозы,

• титрование антигена для определения его рабочей дозы,

• главный опыт – титрование сыворотки.

Гемолитическая система

Исходным материалом для приготовления гемолитической системы служит стандартная гемолитическая сыворотка с титром 1:1200 и 3% взвесь бараньих эритроцитов (табл. 1).

Гемолитическую сыворотку и взвесь эритроцитов готовят в разных колбах, затем сливают в одну колбу и ставят в термостат при 37^оС на 30 мин. Готовую смесь хранят в темном месте при комнатной температуре.

Таблица 1

Соотношение компонентов гемолитической системы для проведения реакции связывания комплемента микрометодом

Объем компонентов, мл	Объем смеси, мл	Объем гемолитической системы, мл
0,025 мл гемолитической сыворотки + 10 мл физиологического раствора 0,3 мл эритроцитов + 9,7 мл физиологического раствора	10 10	20

Титрование комплемента

Для определения рабочей дозы комплемента свежую сыворотку морской свинки титруют в небольших пробирках (удобны пробирки диаметром 5 мм). Исходное разведение сыворотки – 1:10. Необходимые количества комплемента отмеривают микропипеткой. Затем в каждую пробирку приливают по 0,2 мл гемолитической системы. Пробирки инкубируют в термостате при 37^оС в течение 1 ч (табл. 2).

За титр комплемента принимают то минимальное количество комплемента, которое вызывает полный гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (в табл. 2 титр комплемента равен 0,025 мл, рабочая доза – 120 % титра, т.е. 0,03 мл).

Таблица 2

Примерная схема титрования комплемента

№ п/п	Комплемент, мл (1:10)	Физиологический раствор,мл	Примерные результаты
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К*	0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050 -	0,295 0,290 0,285 0,280 0,275 0,270 0,265 0,260 0,255 0,250 0,300	++++ +++ ++ + Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз ++++

К* – контроль гемолитической системы

Титрование антигена

Для определения рабочей дозы антигена его титруют. Для этого в пробирки отмеривают различные количества изучаемого экстракта. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл комплемента, разведенного физиологическим раствором таким образом, чтобы в 0,1 мл содержалась его рабочая доза. Пробирки ставят в термостат при 37^оС на 1 ч. После этого в каждую пробирку приливают по 0,2 мл гемолитической системы и вновь помещают их на 1 ч в термостат (табл. 3).

За титр антигена принимают максимальное количество антигена, при котором еще наблюдается гемолиз (титр антигена равен 0,01 мл, а рабочая доза – 0,005 мл).

Таблица 3

Примерная схема титрования антигена

№ п/п	Антиген, мл	Физиологический раствор, мл	Примерные результаты
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 К* К**	0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0,01 0,004 0,002 0,0004 0,0002 - -	0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,19 0,196 0,198 0,1996 0,1998 0,2 0,3	++++ ++++ +++ ++ + Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз ++++

К* – контроль комплемента;

К** – контроль гемолитической системы.

Главный опыт (с одновременным титрованием сыворотки)

Готовят разведения сыворотки: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. В пробирки разливают по 0,1 мл сыворотки в соответствующих разведениях, начиная с последней пробирки, содержащей сыворотку в максимальном разведении. Затем в каждую пробирку приливают по 0,1 мл разведенного антигена и по 0,1 мл комплемента, содержащих в этом объеме рабочую дозу. Опыт дополняют контролями разведений сыворотки (0,1 мл каждого разведения сыворотки + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента), контролем антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента), контролем гемолитической системы (0,3 мл физиологического раствора). Все пробирки встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. Затем во все пробирки приливают по 0,2 мл гемолитической системы, пробирки снова встряхивают и помещают в термостат на 1 ч (табл. 4).

Таблица 4

Примерная схема постановки главного опыта

№ пробирки	Разведение сыворотки			Антиген (рабочая доза), мл	Физиологи-ческий раствор, мл	Примерные результаты
	1:20	1:40	1:80
1 2 (к)^1 3 4 (к) 5 6 (к) К* К** К***	0,1 0,1	0,1 0,1	0,1 0,1	0,1 - 0,1 - 0,1 - 0,1 - -	- 0,1 - 0,1 - 0,1 0,1 0,2 0,3	++ Гемолиз + Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз Гемолиз ++++

(к)¹ – контрольные пробирки;

К* – контроль антигена;

К** – контроль комплемента;

К*** – контроль гемолитической системы.

При наличии специфической реакции антигена с антителом в пробирках, содержащих и сыворотку, и антиген, наблюдается задержка гемолиза (задержка гемолиза наблюдается в пробирках 1 и 3). За титр исследуемой сыворотки принимают максимальное разведение сыворотки, при котором еще происходит задержка гемолиза (титр сыворотки равен 1:40). При отсутствии специфической реакции антигена с антителом наблюдается полный гемолиз во всех опытных пробирках.

Контрольные вопросы

1. Понятие о системе комплемента, ее роль в организме.

2. На чем основана реакция связывания комплемента?

3. Применение реакции связывания комплемента.