Работа 6. Получение 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллинацилазы, иммобилизованной в полиакриламидный гель

Цель работы: Ознакомление с технологией получения 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллина с помощью иммобилизованного фермента, овладение лабораторными навыками проведения процессов с иммобилизованными ферментами, определение выхода продукта.

6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) является полупродуктом в химическом синтезе ряда полусинтетических антибиотиков. Современная технология получения 6-АПК состоит из следующих основных стадий:

• получение биомассы клеток E.coli, содержащих фермент бензилпенициллинацилазу;

• выделение и очистка фермента;

• иммобилизация фермента в полиакриламидный гель;

• получение 6-АПК.

Последняя стадия включает в себя проведение следующих операций:

• гидролиз бензилпенициллина иммобилизованным ферментом;

• осветление гидролизной жидкости углем и отделение угля;

• осаждение 6-АПК в изоэлектрической точке;

• фильтрация и промывка полученного осадка 6-АПК водой и органическим растворителем;

• вакуум-сушка готового продукта.

Клетки E. сoli выращивают методом глубинной ферментации в течение 24 ч в слабощелочной среде, содержащей очищенный кукурузный экстракт и фенилуксусную кислоту, при 25С при постоянном перемешивании и аэрации. По окончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости сепарацией или центрифугированием. Полученную пасту используют для извлечения фермента с помощью следующих технологических операций:

• экстракция пенициллинацилазы 0,9% раствором бутилацетата в воде при рН 8 и 40С;

• отделение отработанных клеток фильтрацией;

• осаждение неактивных примесей (балластных белков) из бесклеточного экстракта при 5÷8С путем добавления к экстракту сухого сульфата аммония до концентрации 20 мас.%, перемешивании в течение 30 мин и с последующим отделением балластных белков сепарацией или центрифугированием;

• осаждение активного белка-фермента и его отделение. Для этого к осветленному экстракту при 5÷8С вновь добавляют сульфат аммония до уровня 12 мас.%, полученную смесь выдерживают 20 ч, при этом из экстракта выпадает осадок, содержащий преимущественно целевой фермент пенициллинацилазу;

• вакуум-сушка полученного фермента.

Приготовленный таким образом ферментный препарат подвергают иммобилизации в полиакриламидный гель.

Получение иммобилизованной пенициллинацилазы состоит в радикальной полимеризации акриламида и N,N-метилен-бис-акрил-амида в водной среде в присутствии инициаторов – персульфата аммония (NH4)2S2O8 N,N,NN-тетраметилендиамина. В реакционную смесь вводят бифункциональный реагент – глутаровый альдегид, под действием которого молекулы фермента ковалентно связываются с мономерами и сшиваются друг с другом.

Приготовление иммобилизованного фермента завершают промывкой полученного геля водой.

Процесс получения 6-АПК включает в себя последовательное проведение ряда вышеуказанных операций, выполнение которых и составляет экспериментальную часть данной лабораторной работы.

Ход работы

Гидролиз бензилпенициллина под действием иммобилизованного фермента проводят в стеклянном пятигорловом реакторе, снабженном водяной рубашкой, мешалкой, электродами и термокомпенсатором рН-метра. В рубашку реактора подают нагретую до 41С воду, в реактор вносят 100 мл дистиллированной воды, затем точную навеску – 5 г соли бензилпенициллина и включают мешалку. После полного растворения соли в раствор вносят 1 мл концентрированной ортофосфорной кислоты, 15 г гель-фермента и производят начальный отсчет времени. Момент внесения фермента считают началом времени гидролиза.

В течение гидролиза реакционную смесь активно перемешивают.

Гидролиз проводят при рН 7,5÷7,6, величина которого поддерживается добавлением в реакционную среду 12,5% раствора аммиачной воды. Каждые 15 мин необходимо записывать объем щелочи, пошедшей на подтитровку.

С течением времени скорость гидролиза уменьшается, в зависимости от активности фермента процесс заканчивается через 1,5÷2,0 ч. Окончание гидролиза определяется по установившемуся постоянному значению рН раствора.

Реакционную смесь выгружают из реактора, осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера.

Измеряют объем гидролизата и переносят в коническую колбу. Содержимое колбы охлаждают током холодной воды или на водяной бане со льдом до 4÷8С.

Осветление охлажденного гидролизата проводят активированным углем марки “Б”, взятым из расчета 1 г угля на каждые 100 мл гидролизата. После внесения угля содержимое колбы перемешивают в течение 15 мин, затем уголь отделяют от гидролизата фильтрованием в воронке Бюхнера.

Фильтрат переливают в химический стакан и вновь охлаждают в токе холодной воды или на водяной бане с тающим льдом.

После этого стакан устанавливают на столик магнитной мешалки, вводят электроды и термокомпенсатор рН-метра и ротор мешалки. При включенной мешалке по каплям добавляют из бюретки 18÷20% соляную кислоту до тех пор, пока значение рН не достигнет 3,9÷4,1. В этом интервале значений начинают выпадать кристаллы 6-АПК.

Стакан с реакционной массой снимают с мешалки, переносят на водяную баню со льдом или холодильник, где выдерживают не менее 2 ч.

Полученный осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и дважды промывают охлажденной до 4÷8С дистиллированной водой порциями, примерно вдвое большими объема полученного осадка.

Промытый осадок подсушивают на той же воронке Бюхнера и дважды промывают ацетоном порциями, примерно вдвое большими объема осадка.

Ацетон тщательно отсасывают, 6-АПК переносят в предварительно взвешенную тонкостенную чашку Петри.

Окончательное высушивание продукта производят в вакуум-сушильном шкафу при 45÷50С и остаточном давлении 2,5÷4,0 кПа до постоянной массы.

По окончании работы оценивают величину выхода 6-АПК в расчете на прогидролизованный бензилпенициллин. Для этого по химическому уравнению гидролиза бензилпенициллина и количеству израсходованной щелочи сначала находят число гидролизовавшихся миллимолей бензилпенициллина, затем определяют соотношение массы полученного осадка 6-АПК, пересчитанной на число ммоль, к количеству прогидролизованного бензилпенициллина (ммоль).

Для получения дополнительных количественных характеристик ферментативного гидролиза бензилпенициллина студентам может быть предложено уточнить величину выхода 6-АПК на основании результатов йодометрического определения 6-АПК или оценить величину константы Михаэлиса (Км) на основании анализа значений начальных скоростей ферментативной реакции гидролиза бензилпенициллина, протекающей в соответствии со следующей предполагаемой схемой превращения:

Для этого процесс гидролиза бензилпенициллина проводят дважды при одной и той же температуре, одном и том же количестве фермента, но при различном начальном содержании бензилпенициллина. Получают две кинетические кривые расходования бензилпенициллина, в которых определяют начальные скорости процесса его гидролиза (U_гi). В результате решения системы алгебраических уравнений относительно Км и 1/(k₂с_Е) находят численное значение константы Михаэлиса:

Км/{(k₂с_Е)∙[ БПц]о}+1/(k₂с_Е) = 1/U_гi,

где i=1, 2.

Км = (k_-1+k₂)/k₁

Контрольные вопросы

1. Назовите основные технологические стадии получения 6-АПК с помощью иммобилизованных ферментов. Дайте их краткую характеристику.

2. Какие продукты (основные и побочные) могут получаться в результате гидролиза бензилпенициллина?

3. Ваши предложения по утилизации фенилуксусной кислоты, остающейся в гидролизате после осаждения из него кристаллов 6-АПК.

4. Каковы основные стади процесса получения иммобилизованного фермента пенициллинацилазы? Какова роль персульфата аммония и глутарового альдегида при получении иммобилизованного фермента?

5. Какое влияние могут оказать изменения температуры и рН раствора на процесс получения 6-АПК путем гидролиза бензилпенициллина?

6. Какие технологические преимущества имеет вышеописанный способ получения 6-АПК по сравнению с технологией получения 6-АПК в результате направленного химического синтеза?