2.Полимеразная цепная реакция (пцр).

Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить микроб в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.

Необходимо подчеркнуть, что обязательным условием проведения полимеразной цепной реакции является знание нуклеотидной последовательности того или иного объекта исследования (вирус, бактерия и др.). В настоящее время в банках данных имеются практически полные сведения о геноме различных патогенных микробов.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. К.Мюллисом . В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарности, который является маркерным для данного вида возбудителя. In vivo ПЦР включает несколько стадий:

1. Денатурация ДНК.

2. Образование коротких двухцепочечных участков ДНК.

3. Синтез новой цепи ДНК.

При многократном повторении циклов репликации происходит увеличение числа копий фрагмента ДНК. Все это позволяет из единичных клеток микроорганизмов, содержащихся в анализируемом биологическом материале, получить необходимое количество ДНК для их идентификации.

Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой молекулы ДНК. При этом 3'концы этих синтетических олигонуклеотидов должны быть направлены навстречу друг другу. (Праймер - короткая олиго- или полинуклеотидная последовательность со свободной З’ОН-группой, комплементарно связанная с однонитевой ДНК или РНК; с его 3’-конца ДНК-полимераза начинает наращивать полидезоксирибонуклеотидную цепь.)

Таким образом, полимеразная цепная реакция — это многократно повторяющиеся циклы синтеза специфической области ДНК в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидфосфатов, солевого буфера и нуклеотидных праймеров, определяющих границы синтезируемого участка. Полученную смесь прогревают в течение 1 мин при 94 °С, при этом комплементарные нити ДНК разъединяются. Этот этап называют денатурацией ДНК («плавлением»).

Затем температуру снижают до 45 — 65 °С (в зависимости от состава олигонуклеотидов) и выдерживают ее 1,0—1,5 мин. При этом к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3'концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5'концу. Этот этап называют «отжигом». На третьем этапе поддерживается температура 72 °С. Это оптимальная температура для работы применяемой в ПЦР полимеразы. Данный фермент, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, содержащиеся в смеси, достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3 концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется «элонгация» (удлинение).

Циклическое повторение трех приведенных температурных режимов выполняется с помощью автоматических устройств — термоциклеров (амплификаторов).

Как правило, проводится 30 циклов, что теоретически позволяет получить 230 копий участка ДНК возбудителя.

ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

3.У беременной женщины РСК с токсплазменным антигеном отрицательна, ВКП с токсоплазмином + + + +. Как оценить реакции? Что рекомендовать женщине?

Серологическое окно- период когда реакции отрицательны. Взять повторно анализы через неделю.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 55

1. ВИЧ-ассоциированные инфекции – оппортунистические инфекции, осложняющие СПИД.

ВИЧ-инфекция - медленно прогрессирующее инфекционное заболевание, возникающее вследствие заражения вирусом иммунодефицита человека, поражающего иммунную систему, в результате чего организм становится высоко восприимчив к оппортунистическим инфекциям и опухолям, которые в конечном итоге приводят к гибели больного.

Этиология. Вирус иммунодефицита человека относится к семейству РНК-содержащих ретровирусов и классифицирован на сегодня в подсемейство лентивирусов, т. е. вирусов медленных инфекций. ВИЧ генетически и антигенно неоднороден - описаны ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Зрелый вирион ВИЧ - это сферическая частица диаметром около 100 нм, состоящая из сердцевины и оболочки. Геном ВИЧ содержит 3 основных структурных гена - gag, кодирующий образование внутренних белков (p17/18, 24/26, 55/56); env, кодирующий гликопротеины оболочки (gp41/36, 120/105, 160/140) и pol, кодирующий ферментные системы, включая обратную транскриптазу (p31, 51, 66/68). Кроме того, известны регуляторные гены возбудителя (tat, rev, nef), которые обеспечивают контроль за его репликацией. ВИЧ не стоек во внешней среде. Он инактивируется при температуре 56°С за 30 мин, при кипячении - через 1 мин, погибает под воздействием химических агентов, допущенных для проведения дезинфекции. Вирус относительно устойчив к ионизирующей радиации, ультрафиолетовому облучению и замораживанию при минус 70°С.

Эпидемиология. Источником инфекции являются инфицированные люди - больные со всеми клиническими формами и вирусоносители, в крови которых циркулирует вирус. Он содержится в большой концентрации не только в крови, но и в первую очередь в сперме, а также в менструальных выделениях и вагинальном (цервикальном) секрете. Кроме того, ВИЧ обнаруживается в грудном молоке, слюне, слезной и цереброспинальной жидкости, в биоптатах различных тканей, поте, моче, бронхиальной жидкости, кале. Наибольшую эпидемиологическую опасность представляют кровь, сперма и вагинальный секрет, имеющие достаточную для заражения долю инфекта.

Ведущее значение в передаче ВИЧ имеет контактный механизм передачи возбудителя. Он включает половой (наиболее частый) и контактно-кровяной (трансфузионный, парентеральный и при контакте с кровью) пути передачи вируса. Особенно интенсивная передача ВИЧ наблюдается при гомосексуальных половых контактах, при этом риск заражения пассивного гомосексуалиста в 3-4 раза больше, чем активного. Большая вероятность заражения половым путем и при би- и гетеросексуальных контактах с больными (носителями), причем инфицирование женщин от мужчин происходит несколько чаще, чем мужчин от женщин. ВИЧ передается также через инфицированную кровь. Это происходит при переливании крови и некоторых ее препаратов. Вирус может передаваться при повторном использовании инфицированного медицинского инструментария, в том числе шприцев и игл. Чаще всего это происходит у наркоманов при внутривенном введении наркотических препаратов одними и теми же шприцами и иглами.

Другим, менее значимым, является вертикальный механизм передачи возбудителя, который реализуется в организме беременной женщины, когда плод заражается в матке (трансплацентарный путь). Необходимо отметить, что риск передачи ВИЧ детям от сероположительных матерей составляет 15-30% (по некоторым источникам до 50%), зависит от стадии заболевания и увеличивается при грудном вскармливании. При этом наиболее часто контактное заражение ребенка происходит при родах. Также возможно инфицирование через грудное молоко. Выявлены случаи заражения матерей от инфицированных грудных детей при вскармливании грудью.

Трансмиссивная передача ВИЧ практически невозможна, так как возбудитель в организме кровососов не размножается. Бытовая передача вируса при обычном общении людей не установлена. ВИЧ не передается через воздух, питьевую воду и пищевые продукты.

Патогенез. Заражение человека ВИЧ происходит при попадании вирус-содержащего материала непосредственно в кровь или на слизистые оболочки. Проникнув в организм человека, возбудитель способен прямо инфицировать довольно много разных типов дифференцированных клеток: прежде всего CD4-лимфоциты (хелперы), а также моноциты/макрофаги, альвеолярные макрофаги легких, клетки Лангерганса, фолликулярные дендритные клетки лимфатических узлов, клетки олигодендроглии и астроциты мозга, эпителиальные клетки кишки, клетки шейки матки. Основным способом попадания ВИЧ внутрь клетки является его связывание со специфическим рецептором клеточной оболочки (молекулой CD4) с последующей пенетрацией путем эндоцитоза или через плазматическую мембрану. После проникновения вирусного генома в цитоплазму информация с вирусной РНК с помощью обратной транскриптазы переписывается на ДНК. Затем к образовавшейся однонитевой структуре ДНК с помощью того же фермента достраивается вторая нить ДНК, а линейная промежуточная форма ДНК транспортируется в ядро, где приобретает кольцевую форму, интегрируется с ДНК клетки, превращаясь в ДНК-провирус.

ВИЧ-инфекция атакует организм таким образом, что иммунная система становится неспособной противостоять вирусам и инфекциям, с которыми она успешно борется у здоровых людей. Когда иммунитет ослаблен, организм теряет свою защиту и становится уязвимым для микробов и инфекций. Инфекции, проникающие в организм, ослабленный ВИЧ, называются «оппортунистическими», от английского «opportunity» - возможность.

У пациентов с диагнозом СПИД часто развиваются оппортунистические инфекции, которые имеют неспецифические симптомы, например, лихорадку и снижение веса. Такие инфекции могут быть вызваны внутриклеточной Mycobacterium avium и цитомегаловирусом. Цитомегаловирус может вызывать колиты и воспаление сетчатки.

Пенициллоз, вызванный Penicillium marneffei, является третьей по частоте формой оппортунистических инфекций (после внелёгочного туберкулёза и криптококкоза), которая проявляется у ВИЧ-положительных лиц в эндемичном районе Юго-Восточной Азии

У пациентов с диагнозом СПИД часто бывает нераспознанной инфекция парвовирусом В19. Одной из наиболее частых последствий является анемия, которую тяжело отличить от анемии, вызванной антиретровирусными лекарствами для лечения СПИД.