Тема 5. Віруси рослин.

Для культивування вірусів, в залежності від їх властивостей і від поставлених задач, використовують 4 типи рослин-господарів:

1)рослини, в яких вірус може зберігатися довгий час;

2) рослини, на яких легко виявляються симптоми, характерні для зараження даним вірусом;

3) рослини, з яких можна отримати великі кількості вірусу;

4) рослини, які використовують для оцінки інфекційності вірусу.

Для цих цілей використовують, як правило, різні види рослин. Так, наприклад, вірус мозаїки люцерни можна довгий час зберігати в люцерні, його найбільш високе накопичення спостерігається при культивуванні у тютюну, для визначення його ефективності використовують листя квасолі звичайної, а характерні симптоми, які відрізняють його від інших вірусів виявляються на тютюну, квасолі та Chenopodium amaranticolor.

Метод механічної інокуляції.

Метод механічної інокуляції – найбільш поширений в лабораторній практиці спосіб засіб передачі вірусів здоровій рослині.

При механічній передачі інфекційний вірус (або його РНК) вводиться в клітину через пошкодження (мікротравми) кутикули листя, що викликається застосуванням при інокуляції абразивом. Дрібні (400-700 мкм) абразивні порошки діатомових водоростей (наприклад, "целіт") є найбільш ефективним матеріалом для цієї операції. Для механічної інокуляції поверхня листя опилюється абразивним порошком, потім наноситься 1-2 краплі вірусної суспензії на оброблену абразивом поверхню і за допомогою скляної палички або пластикової петлі інокулят разом з абразивом рівномірно розподіляється на поверхні ураженого листя. Цю операцію необхідно виконувати з врахуванням багатьох факторів: виду рослини, віку та стану листя, якості абразивного порошку та інших.

Методом механічної інокуляції краще всього передаються віруси, які достигають в рослинах високої концентрації та здатні уражати як епідерміс, так і інші тканини. До цієї категорії відносяться віруси, що викликають мозаїку, крапчатість або кільцеву плямистість. Після певного часу з моменту зараження чутливих до вірусу видів рослин можуть розвитися симптоми інфекції.

Віруси здатні заражати на тільки цілий організм господаря, але його окремі клітини, які вирощують у культурі (але і культурі клітин). Ціла клітинна оболонка рослин не доступна для вірусів і, якщо таку рослину обробити препаратом вірусу, зараження не відбудеться. Але, якщо зруйнувати клітинну оболонку рослини пектиназами і целюлазами, то отримані протопласти легко заражаються вірусом при додавання його у середовище для культивування протопластів. Протопласти використовують для культивування вірусів тютюнової мозаїки, огіркової мозаїки, Х- вірусу картоплі та інші.

Різні види рослин-хазяїв реагують на інфекцію по-різному. Характер реакції рослини залежить від її генетичної природи і від типу інфекції, якої заражають рослину. Відрізняють 4 основних типи реакції рослини на зараження їх вірусом:

1) імунність – рослина не заражається даним вірусом;

2) понадчутливість – рослина заражається з утворенням уражень (некрозів), які з‘являються в наслідок відмирання клітин навколо точки зараження;

3) толерантність – вірус розповсюджується по тканинам рослини, але симптоми захворювання виражені слабо;

4) системні ураження – вірус розповсюджується по всім тканинам рослини з яскраво вираженими симптомами захворювання.

Симптоми захворювання можуть бути різними: мозаїка, деформація листя, просвітління жилок, утворення хлоротичних плям різної форми. між цими типами реакції рослини на вірусну інфекцію іноді відсутні чіткі межі. Наприклад, тяжко відрізнити реакцію толерантності і системного ураження. У деяких рослин після механічної інокуляції спочатку утворюються некрози (зверхчутливість), далі рослини уражуються системно.

Але при вірному підборі рослин -хазяїв, а також при певних умовах інокуляції та культивування інфікованих рослин можливо отримати чіткі характерні картини інфекції.

Для кожного з вивчених вірусів можна підібрати набір рослин, які будуть специфічно редагувати на інфекцію (рослини – індикатори вірусу). Різні штами вірусу можуть відрізнятися по набору чутливих рослин-хазяїв або викликати різні типи реакції при ураженні рослин-індикаторів. Так наприклад, штам Vulgare ВТМ викликає системну реакцію на рослинах Nicotiana sylvestris L., та Nicotiana tabacum L. var Samsun EN, в той час як інші штами ВТМ викликають на цих рослинах некротичну реакцію.

Таким чином, при використанні набору рослин-індикаторів, можливо ідентифікувати даний вірус та визначити його в суміші з іншими вірусами. Такий метод ідентифікації вірусів називається візуальний.

Для ідентифікації вірусу за допомогою набору різних рослин індикаторів виконують такі операції:

1. Вимити руки, робочу поверхню стола, інструменти, роботи проводити на чистому листі фільтрувального паперу.

2. За допомогою механічної інокуляції проводять зараження 2-3 листків рослини глютинози, дурману, хеноподіуму, ячменю, квасолі.

3. Залишок вірусного препарату змивають дистильованою водою.

4. Спостерігають за станом рослини протягом 12 діб з моменту зараження; визначають симптоми інфекції та час з‘явлення симптомів. Ідентифікацію вірусів проводять на основі характеру уражень індикаторних рослин або відсутності інфекції у імунних до даного вірусу рослин.

Для перевірки результатів, отриманих за допомогою візуального методу, використовують серологічні реакції з антисироватками до кожного із визначених вірусів та екстрактами рослин з системною інфекцією. Аглютинація хлоропластів – найпростіший тест для вірусів рослин. Краплю антисироватки або нормальної сироватки змішують з краплею соку зараженої рослини. Якщо вірусні частки вступають в реакцію з антисироваткою, то відбувається аглютинація хлоропластів. Для титрування вірусних антигенів широко використовують серологічний тест – аглютинація. Для проведення цього тесту вірусний антиген у різних розведеннях змішують з одним і тим ж розведенням антисироватки і спостерігають утворення преципітату. Визначають оптимальне співвідношення концентрації антигену до антитіл при якому найшвидше утворюється преципітат та кінцеве розведення антигену, при якому можливе утворення видимого преципітату.

Серед мікроскопічних методів виявлення вірусів в рослинних клітинах широко використовується метод люмінесцентної та електронної мікроскопії. Використання флуорехрому – акридинжовтогарячого дозволяє виявити локалізацію та тип нуклеїнової кислоти.

Для дослідження ультраструктури інфікованих вірусами клітин використовують методику: фіксують невеликий шматочок тканини визначеними хімічними речовинами (наприклад чотириокис осмію), обезводжують, домішують епоксидну смолу, за допомогою скляного ножа зразок ріжуть на шматочки товщиною 50-100 нм і зрізи обробляють солями урану або свинцю та досліджують в електронному мікроскопі.

Мірою інфекційності вірусного препарату є визначення долі інфікованих клітин або час появи симптомів інфекції. В першому випадку, відносно невелика кількість вірусних часток контактує з клітинами рослин, інфікується незначна кількість клітин з утворенням некротичних уражень. Кількість уражень на кожному листі залежить від концентрації вірусу в інокуляті. У другому випадку, коли рослина інфікується одночасно кількома дозами вірусу, за міру концентрації вірусу використовують, залежний від дози, кількісний параметр інфекційного процесу – час появи симптомів.