Тема 3. Особливості розмноження вірусів тварин.

Роздягання

Прониклі в клітину вірусні частки повинні роздягнутися для того, щоб викликати інфекційний процес. Зміст роздягання полягає у видаленні вірусних захисних оболонок, які перешкоджають експресії вірусного генома. У результаті роздягання звільняється внутрішній компонент вірусу, який здатен викликати інфекційний процес. Роздягання супроводжується рядом характерних особливостей: у результаті розпаду вірусної частки зникає інфекційна активність, у ряді випадків з'являється чутливість до нуклеаз, виникає стійкість до нейтралізуючої дії антитіл, втрачається фоточутливість при використанні ряду препаратів.

Кінцевими продуктами роздягання є серцевини, нуклеокапсиди або нуклеїнові кислоти. Для ряду вірусів було показано, що продуктом роздягання являються не голі нуклеїнові кислоти, а нуклеїнові кислоти, пов'язані із внутрішнім вірусним білком. Наприклад, кінцевим продуктом роздягання пікорнавірусів є РНК, ковалентно пов'язана з білком Vpg, кінцевим продуктом роздягання аденовірусів, вірусу поліоми та SV40 є ДНК, ковалентно пов'язана з одним із внутрішніх вірусних білків.

У ряді випадків здатність вірусів викликати інфекційний процес визначається можливістю їх роздягання в клітині даної системи. Тим самим ця стадія є однієї зі стадій, що лімітують інфекцію.

Роздягання ряду вірусів відбувається в спеціалізованих ділянках усередині клітини (лізосомах, структурах апарата Гольджі, навколоядерному просторі, ядерних порах на ядерній мембрані). При злитті вірусної й клітинної мембран проникнення в клітину сполучається з роздяганням.

Роздягання й внутрішньоклітинний транспорт є взаємозалежними процесами: при порушенні правильного внутрішньоклітинного транспорту до місць роздягання вірусна частка попадає в лізосому та руйнується лізосомальними ферментами.

Проміжні форми при роздяганні. Роздягання вірусної частки здійснюється поступово в результаті серії послідовних реакцій. Наприклад, у процесі роздягання пікорнавіруси проходять ряд стадій з утворенням проміжних субвірусних часток з розмірами від 156 S до 12 S. Роздягання вірусів ECHO має наступні стадії: віріони (156 S) -> А-Частки (130 S) -> РНК і порожні капсиди (80 S) РНК із термінальним білком (12 S). Роздягання аденовірусів відбувається в цитоплазмі і ядерних порах і має принаймні 3 стадії: 1) утворення субвірусних часток з більшою щільністю, ніж віріони; 2) утворення серцевин, у яких відсутні 3 вірусних білка; 3) утворення ДНК-білкового комплексу, у якому ДНК ковалентно з'єднана з термінальним білком. Вірус поліоми в процесі роздягання втрачає зовнішні білки й перетворюється в субвірусну частку з коефіцієнтом седиментації 48 S. Потім частки зв'язуються з ядерними білками (гістонами) і формується 190 S комплекс (з коефіцієнтом седиментації 190 S), здатний викликати інфекційний процес. Вірус грипу спочатку втрачає ліпопротеїдну оболонку й перетворюється в субвірусну частку, з якої після видалення М-білка звільняється нуклеокапсид.

Транскрипція

Транскрипція — це перепис ДНК на РНК за законами генетичного коду. Це означає, що РНК складається з нуклеотидних послідовностей, комплементарних ДНК. Нитки ДНК у ділянці транскрипції розділяються й функціонують як матриці, до яких приєднуються комплементарні нуклеотиди завдяки спарюванню комплементарних основ (аденін зв'язується з тиміном, урацил — з аденіном, гуанін — із цитозином і цитозин — з гуаніном). Транскрипція здійснюється за допомогою спеціального ферменту — РНК-полімерази, який зв'язує нуклеотиди шляхом утворення 3'-5'-фосфодіефірних містків. Таке зв'язування відбувається лише при наявності ДНК-матриці.

Продуктами транскрипції в клітині є іРНК. Сама клітинна ДНК, що є носієм генетичної інформації, не може безпосередньо програмувати синтез білка. Передачу генетичної інформації від ДНК до рибосом здійснює РНК-посередник. На цьому заснована центральна догма молекулярної біології, яка виражається наступною формулою:

Транскрипція→трансляція ДНК → РНК → білок,

де стрілки показують напрямок переносу генетичної інформації.

Реалізація генетичної інформації у вірусів. Стратегія вірусного генома відносно синтезу іРНК у різних вірусів різна. У ДНК-вмісних вірусів іРНК синтезується на матриці однієї з ниток ДНК. Формула переносу генетичної інформації в них така ж, як і в клітині.

транскрипція→трансляція ДНК→ РНК → білок.

ДНК-вмісні віруси, репродукція яких відбувається в ядрі, використовують для транскрипції клітинну полімеразу. До цих вірусів відносяться паповавіруси, аденовіруси, віруси герпеса. ДНК-вмісні віруси, репродукція яких відбувається в цитоплазмі, не можуть використовувати клітинний фермент, що знаходиться в ядрі. Транскрипція їх генома здійснюється вірусспецифічним ферментом — ДНК-полімеразой, яка проникає в клітину в складі вірусу. До цих вірусів відносяться віруси віспи й іридовіруси.

РНК-вмісні віруси, у яких зберігачем генетичної інформації є не ДНК, а РНК, вирішують цю проблему особливим образом. У РНК-вмісних «плюс-ниткових» вірусів, у яких функції іРНК виконує сам геном, передача генетичної інформації здійснюється за найбільш простою формулою:

РНК→білок

До цієї групи вірусів відносяться пікорнавіруси, тогавіруси, коронавіруси. В них немає необхідності в акті транскрипції для синтезу вірусспецифічних білків. Тому транскрипцію як самостійний процес у цих вірусів не виділяють. Інакше справа у вірусів, геном яких не може виконувати функцію іРНК. У клітині синтезується комплементарна геному РНК, яка і є інформаційною. Передача генетичної інформації у цих вірусів здійснюється по формулі:

РНК→РНК білок

У цих вірусів транскрипція виділена як самостійний процес в інфекційному циклі. До них відносяться дві групи вірусів тварин.

Віруси, геном яких представлений однонитчатою РНК: ортоміксовіруси, параміксовіруси, рабдовіруси, буньявіруси. Оскільки геномна РНК цих вірусів є «мінус-ниткою», зазначену групу вірусів називають «мінус-нитковими» вірусами.

Віруси, геном яких представлений двонитчатою РНК (діплорнавіруси). Серед вірусів тварин до них відносяться реовіруси.

У клітині немає ферменту, який може полімеризувати нуклеотиди на матриці РНК. Цю функцію виконує вірусспецифічний фермент — РНК-полімераза, або транскриптаза, яка міститься в складі вірусів і разом з ними проникає в клітину.

Серед РНК-вмісних вірусів тварин є сімейство ретровірусів, які мають унікальний шлях передачі генетичної інформації. РНК цих вірусів переписується на ДНК, ДНК інтегрує із клітинним геномом і в його складі переписується на РНК, яка має інформаційні функції. Шлях передачі генетичної інформації в цьому випадку здійснюється по більш складній формулі:

РНК → ДНК → РНК → білок

У складі цих вірусів є унікальний вірусспецифічний фермент, який переписує РНК на ДНК. Цей процес називається зворотною транскрипцією, а фермент — зворотна транскриптаза, або ревертаза. Той же фермент синтезує нитку ДНК на матриці ДНК. Двонитчата ДНК після замикання в кільце інтегрує із клітинним геномом, і транскрипцію інтегрованої ДНК у складі клітинних геномів здійснює клітинна РНК-полімераза. Оскільки іРНК ретровірусів гомологічна геномній РНК (а не комплементарна їй), ретровіруси є «плюс-нитковими» вірусами.

Ферменти, що транскрибують вірусний геном. Транскрипція ряду ДНК-вмісних вірусів — паповавірусів, аденовірусів, вірусів герпеса, парвовірусів, гепадна-вірусів здійснюється в ядрі клітини, і в цьому процесі широко використовуються механізми клітинної транскрипції — ферменти транскрипції й подальшої модифікації транскриптів. Транскрипція цих вірусів здійснюється клітинною РНК-полімеразою ІІ — ферментом, який здійснює транскрипцію клітинного генома. Однак особлива група транскриптів аденовірусу синтезується за допомогою іншого клітинного ферменту — РНК-полімерази III. У двох інших сімейств ДНК-вмісних вірусів тваринних вірусів віспи й іридовірусів — транскрипція відбувається в цитоплазмі. Оскільки в цитоплазмі немає клітинних полімераз, транскрипція цих вірусів потребує спеціального вірусного ферменту — вірусної РНК-полімерази. Цей фермент є структурним вірусним білком.

У РНК-вмісних вірусів транскрипція здійснюється вірусспецифічними транскриптазами, тобто ферментами, закодованими у вірусному геномі. Вірусспецифічні транскриптази можуть бути як структурними білками, що входять до складу віріона (ендогенна транскриптаза), так і неструктурними білками, які синтезуються в зараженій клітині, але не включаються у віріон.

Транскрипція в зараженій клітині. Синтез комплементарних РНК на батьківських матрицях за допомогою батьківської транскриптази називається первинною транскрипцією на відміну від вторинної транскрипції, що відбувається на більш пізних стадіях інфекційного циклу на знову синтезованих, дочірніх матрицях, за допомогою вдруге синтезованої транскриптази. Більша частина іРНК у зараженій клітині є продуктом вторинної транскрипції.

Транскриптивні комплекси. У складно влаштованих РНК-вмісних вірусів тварин транскрипція відбувається не на матриці голої РНК, а в складі вірусних нуклеокапсидів або серцевин (транскриптивні комплекси). Пов'язані з геномом капсидні білки не тільки не перешкоджають транскрипції, але й необхідні для неї, забезпечуючи правильну конформацію тяжа РНК, захист його від клітинних протеаз, зв'язок окремих фрагментів генома один з одним, а також регуляцію транскрипції.

Вдруге синтезовані іРНК виходять із транскриптивних комплексів і транспортуються до рибосом.

На моделі реовірусів було показано, що обидві нитки двонитчатих молекул РНК залишаються в складі серцевини, а вдруге синтезовані іРНК виштовхуються із серцевини через отвори в 12 порожніх циліндрів, що перебувають у складі серцевини.

Регуляція транскрипції. Транскрипція вірусного генома строго регулюється протягом інфекційного циклу. Регуляція здійснюється як клітинними, так і вірусспецифічними механізмами. У деяких вірусів, в більшості ДНК-вмісних, існує три періоди транскрипцій — передрання, рання й пізня. До цих вірусів ставляться віруси віспи, герпеса, паповавіруси, аденовіруси. У результаті передранньої і ранньої транскрипції вибірково зчитуються передранні й ранні гени з утворенням передранніх або ранніх іРНК. При пізній транскрипції зчитується інша частина вірусного генома — пізні гени, з утворенням пізніх іРНК. Кількість пізніх генів звичайно перевищує кількість ранніх генів. Багато передранніх генів є генами для неструктурних білків — ферментів і регуляторів транскрипції й реплікації вірусного генома. Напроти, пізні гени звичайно є генами для структурних білків. Звичайно при пізній транскрипції зчитується весь геном, але з перевагою транскрипції пізніх генів.

Фактором регуляції транскрипції в ядерних вірусів є транспорт транскриптів з ядра в цитоплазму, до місця функціонування іРНК — полісомам.

Продуктом передранньої транскрипції вірусів герпеса є а-білки. Функція одного або декількох з них необхідна для транскрипції наступної групи генів, що кодують Р-білки. У свою чергу Р-білки включають транскрипцію останньої групи пізніх генів, що кодують у-білки. Такий тип регуляції одержав назву «каскадної».

У РНК-вмісних вірусів синтез транскриптів також строго контролюється у відношенні як кількості кожного класу транскриптів, так і періоду інфекції, коли певні транскрипти синтезуються з максимальною швидкістю. На ранній стадії інфекції переважно синтезуються транскрипти двох генів вірусу грипу — 1ЧР і N8, на пізній стадії інфекції — транскрипти генів М, НА й ІА. Інші три гени для Р-білків синтезуються приблизно з однаковою швидкістю протягом усього періоду інфекції. У реовірусів на ранній стадії інфекції переважно транскрибується 4 з 10 фрагментів генома й лише на пізній стадії транскрибується весь геном. Однак якщо помістити геном вірусу в безклітинну РНК-синтезуючу систему, буде відбуватися рівномірна транскрипція всіх 10 фрагментів генома. Ці факти говорять про твердий контроль транскрипції з боку клітини-хазяїна й можливій наявності специфічних клітинних регуляторів.

У параміксовірусів й рабдовірусів весь геном являє собою одну транскрипційну одиницю з єдиним промотором (ділянка зв'язування транскриптази й початку транскрипції) у 3'-кінця. Уздовж генома існує як би градієнт ефективності транскрипції. Найближчий до 3'-кінця ген (ген білка 14Р) зчитується найчастіше. Напроти, ген для найбільш високомолекулярного білка — транскриптази — що міститься лише в кількості декількох молекул на віріон, знаходиться на протилежному кінці генома й транскрибується значно рідше. Така регуляція експресії генів шляхом порядку їх розташування в геномі називається «полярність». При цьому способі регуляції кількість молекул поліпептидів визначається полярністю гена, тобто відстанню його від промотору.

Трансляція

Синтез білка в клітині відбувається в результаті трансляції іРНК. Трансляцією називається процес переводу генетичної інформації, що міститься в іРНК, на специфічну послідовність амінокислот. Іншими словами, у процесі трансляції здійснюється переклад 4-хлітерної мови азотистих основ на 20-тилітерну мову амінокислот.

Транспортні РНК. Свою амінокислоту тРНК пізнають по конфігурації її бічного ланцюга, а специфічний фермент аміноацилсинтетаза каталізує асоціацію тРНК із амінокислотою. У клітині існує велика кількість різноманітних видів тРНК. Оскільки для кожної амінокислоти повинна бути своя тРНК, кількість видів тРНК повинна бути не менше 20, однак у клітині їх значно більше. Це пов'язане з тим, що для кожної амінокислоти існує не один, а кілька видів тРНК. Молекула тРНК являє собою однонитчату РНК зі складною структурою у вигляді кленового листа. Один її кінець зв'язується з амінокислотою (кінець а), а протилежний — з нуклеотидами іРНК, яким вони комплементарні (кінець б). Три нуклеотида на іРНК кодують одну амінокислоту й називаються «триплет» або «кодон», комплементарні кодону три нуклеотида на кінці тРНК називаються «антикодон».

Рибосоми. Синтез білка в клітині здійснюється на рибосомі. Рибосома складається із двох субодиниц, великої і малої, мала субодиниця приблизно у два рази менше великої. Обидві субодиниці містять по одній молекулі рибосомальної РНК і ряд білків. Рибосомальні РНК синтезуються в ядрі на матриці ДНК за допомогою РНК-полімерази I. У малій рибосомальній субодиниці є канал, у якому перебуває інформаційна РНК. У великій рибосомальній субодиниці є дві порожнини, що захоплюють також малу рибосомальну субодиницю. Одна з них містить аміноацильний центр ( А-Центр), інша — пептидильний центр ( П-Центр).

Фази трансляції. Процес трансляції складається із трьох фаз: 1) ініціації, 2) елонгації й 3) термінації.

Ініціація трансляції. Це найбільш відповідальний етап у процесі трансляції, заснований на впізнаванні рибосомою іРНК і зв'язуванні з її особливими ділянками. Рибосома пізнає іРНК завдяки «шапочці» на 5'-кінці й сковзає до 3'-кінцю, поки не досягне ініціаторного кодону, з якого починається трансляція. В еукариотичній клітині ініціаторним кодоном є кодон АУГ або ГУГ, що кодують метіонін. З метіоніну починається синтез усіх поліпептидних ланцюгів.

Спочатку з іРНК зв'язується мала рибосомальна субодиниця. До комплексу іРНК із малою рибосомальною субодиницею приєднуються інші компоненти, необхідні для початку трансляції. Це кілька молекул, які називаються «ініціаторні фактори».

Їх принаймні три в прокаріотичній клітині й більш дев'яти в еукаріотичній клітині. Ініціаторні фактори визначають впізнавання рибосомою специфічних РНК і, таким чином, є визначальним чинником у дискримінації між різними іРНК, присутніми в клітині, як правило, у надлишковій кількості.

У результаті формується комплекс, необхідний для ініціації трансляції, який називається ініціаторним комплексом. В ініціаторний комплекс входять: 1) іРНК; 2) мала рибосомальна субодиниця; 3) аміноацил-тРНК, що несе ініціаторну амінокислоту; 4) ініціаторні фактори; 5) кілька молекул ГТФ.

У рибосомі здійснюється злиття потоку інформації з потоком амінокислот. Аміноацил-тРНК входить в А-Центр великої рибосомальної субодиниці, і її антикодон взаємодіє з кодоном іРНК, що перебуває в малій рибосомальній субодиниці. При просуванні іРНК на один кодон тРНК перекидається в пептидильний центр, і її амінокислота приєднується до ініціаторної амінокислоти з утворенням першого пептидного зв'язку. Вільна від амінокислоти тРНК виходить із рибосоми й може знову функціонувати в транспорті специфічних амінокислот. На її місце з А-центру в П-центр перекидається нова тРНК і утворюється новий пептидний зв'язок. В А-Центрі з'являється вакантний кодон іРНК, до якого негайно приєднується відповідна тРНК і відбувається приєднання нових амінокислот до зростаючого поліпептидного ланцюга.

Елонгація трансляції. Це процес подовження, нарощування поліпептидного ланцюга, заснований на приєднанні нових амінокислот за допомогою пептидного зв'язку. Відбувається постійне протягання нитки іРНК через рибосому й «декодування» закладеної в ній генетичної інформації. іРНК функціонує на декількох рибосомах, кожна з яких синтезує ту саму поліпептидну нитку, що кодується даною іРНК. Група рибосом, що працюють на одній молекулі іРНК, називається полірибосомою, або полісомою. Розмір полісом значно варіює залежно від довжини молекули іРНК, а також від відстані між рибосомами. Так, полісоми, які синтезують гемоглобін, складаються з 4—6 рибосом, високомолекулярні білки синтезуються на полірибосомах, що містять 20 і більш рибосом.

Термінація трансляції. Термінація трансляції відбувається в той момент, коли рибосома доходить до термінуючого кодону в складі іРНК. Трансляція припиняється, і поліпептидний ланцюг звільняється з полірибосоми. Після закінчення трансляції полірибосоми розпадаються на субодиниці, які можуть увійти до складу нових полірибосом.

Властивості полірибосом. За топографією в клітині полірибосоми ділять на дві більші групи — вільні й пов'язані з мембранами ендоплазматичної сітки, які становлять відповідно 75% і 25%. Між двома групами полірибосом немає принципових структурних і функціональних відмінностей, вони формуються з того самого пулу субодиниць і в процесі трансляції можуть обмінюватися субодиницями. Мембрани, з якими зв'язані полірибосоми, називаються грубими або шорсткуватими мембранами на відміну від гладких мембран, що не містять полірибосоми. Зв'язок полірибосом з мембранами здійснюється за допомогою сигнального пептиду — специфічної послідовності на аминоконці синтезованих глікопротеїдов. На пов'язаних з мембранами полірибосомах синтезуються усередині мембранні білки, які відразу ж після синтезу виявляються в складі мембран.

Трансляція в заражених вірусом клітинах. Стратегія вірусного генома, що використовує клітинний апарат трансляції, повинна бути спрямована на створення механізму для пригнічення трансляції власних клітинних іРНК і для виборчої трансляції вірусних іРНК, які завжди перебувають у значно меншій кількості, ніж клітинні матриці. Цей механізм реалізується на рівні специфічного дізнавання малою рибосомальною субодиницею вірусних іРНК, тобто на рівні формування ініціюючого комплексу. Оскільки багато вірусів не пригнічують синтез клітинних іРНК, у заражених клітинах виникає парадоксальна ситуація: припиняється трансляція величезного фонду функціонально активних клітинних іРНК, і на рибосомах, що звільнилися, починається трансляція одиночних молекул вірусних іРНК. Специфічне дізнавання рибосомою вірусних іРНК здійснюється за рахунок вірусоспецифічних ініціаторних факторів.

Два способи формування вірусних білків. Оскільки геном вірусу тварин представлений молекулою, що кодує більш ніж один білок, віруси поставлені перед необхідністю синтезу або довгої іРНК, що кодує один гігантський поліпептид-попередник, який потім повинен бути нарізаний у специфічних точках на функціонально активні білки, або коротких моноцистронних іРНК, кожна з яких кодує один білок. Таким чином, існують два способи формування вірусних білків: 1) іРНК транслюється в гігантський поліпептид-попередник, який після синтезу послідовно нарізається на зрілі функціонально активні білки; 2) іРНК транслюється з утворенням зрілих білків, або білків, які лише незначно модифікуються після синтезу.

Перший спосіб трансляції характерний для РНК-вмісних «плюс-ниткових» вірусів — пікорнавірусів і тогавірусів. Їх іРНК транслюється в гігантський поліпептидний ланцюг, так званий поліпротеїд, який сповзає у вигляді безперервної стрічки з рибосомного «конвеєра» і нарізається на індивідуальні білки потрібного розміру. Нарізування вірусних білків є багатоступінчастим процесом, здійснюваним як вірусоспецифічними, так і клітинними протеазами. У клітинах, заражених пікорнавірусами, на кінці поліпротеїна-попередника знаходиться білок із протеазною активністю. Вірусна протеаза здійснює нарізування попередника на 3 фрагмента, один з яких є попередником для структурних білків, другий — для неструктурних білків, функції третього фрагмента невідомі. В подальшому нарізуванні беруть участь вірусоспецифічні й клітинні протеази.

Цікавий варіант першого способу трансляції виявляється в альфа-вірусів (сімейство тогавірусів). Геномна РНК із коефіцієнтом седиментації 42 транслюється з утворенням поліпептиду-попередника для неструктурних білків. Однак домінуючою в заражених клітинах іРНК є РНК із коефіцієнтом седиментації 26 Б, що складає одну третину геномної РНК. Ця іРНК транслюється з утворенням попередника для структурних білків.

Другий спосіб формування білків характерний для ДНК-вмісних вірусів і більшості РНК-вмісних вірусів. При цьому способі синтезуються короткі моноцистронні іРНК у результаті виборчої транскрипції однієї ділянки генома (гена). Однак усі віруси широко використовують механізм посттрансляційного нарізування білка.

Вірусоспецифічні полісоми. Оскільки довжина вірусних іРНК варіює в широких межах, розмір вірусоспецифічних полісом також широко варіює: від 3-4 до декількох десятків рибосом на одній нитці іРНК. При інфекціях, викликаних пікорнавірусами, формуються великі полісоми, що представляють собою агрегати, що складаються із 20—60 рибосом. При інфекціях, викликаних іншими вірусами тварин, що використовують другий спосіб трансляції, формуються полісоми невеликого розміру. Між розмірами іРНК і величиною полісом існує певна кореляція, однак у ряді випадків полісоми мають більший або менший розмір у порівнянні з очікуваним. Ця особливість вірусних полісом пояснюється незвичайним просторовим розташуванням рибосом на вірусних матрицях, пов'язаних з меншою щільністю упаковки рибосом на молекулі іРНК.

Вірусоспецифічні полісоми можуть бути як вільними, так і пов'язаними з мембранами. У заражених вірусом поліомієліту клітинах поліпротеїд синтезується на пов'язаних з мембранами полісомах; при інфекціях, викликаних складно влаштованими вірусами, формуються як вільні, так і пов'язані з мембранами полісоми, які залучені в синтез різних класів вірусних поліпептидів. Внутрішні білки звичайно синтезуються на вільних полісомах, глікопротеїди завжди синтезуються на полісомах, пов'язаних з мембранами.

Модифікація вірусних білків. В еукаріотичній клітині багато білків, у тому числі вірусні, зазнають посттрансляційних модифікацій, і зрілі функціонально активні білки часто не ідентичні їхнім вдруге синтезованим попередникам. Широко поширені такі посттрансляційні ковалентні модифікації, як глікозилювання, ацилювання, метилювання, сульфування (утворення дисульфідних зв'язків), протеолітичне нарізування й, нарешті, фосфорилювання. У результаті замість 20 генетично закодованих амінокислот з різних клітин різних органів еукаріот виділене близько 140 дериватів амінокислот.

Серед широкого спектра модифікованих реакцій лише невелика кількість процесів є оборотною: 1) фосфорилювання-дефосфорилювання; 2) ацилювання-деацилювання; 3) метилювання-деметилювання; 4) утворення дисульфідних зв'язків. Серед подібних оборотних модифікацій білків слід шукати процеси, що обумовлюють механізм регуляції активності білків в еукаріотичній клітині.

Гликозилювання. У складі складно влаштованих РНК- і ДНК-вмісних вірусів є білки, що містять ковалентно приєднані бічні ланцюжки вуглеводів — глікопротеїди. Глікопротеїди розташовані в складі вірусних оболонок і знаходяться на поверхні вірусних часток. Своєю гідрофобною частиною вони занурені в подвійний шар ліпідів, а деякі глікопротеїди проникають через нього й взаємодіють із внутрішнім компонентом вірусу. Гідрофільна частина молекули звернена назовні.

Синтез і внутрішньоклітинний транспорт глікопротеїдів характеризується рядом особливостей, властивих клітинним внутрішньомембранним білкам. Їхній синтез здійснюється на полісомах, асоційованих з мембранами, і білки відразу ж після синтезу попадають у шорсткуваті мембрани, звідки транспортуються в мембрани ендоплазматичної сітки й у комплекс Гольджі, де відбувається модифікація й комплектування вуглеводного ланцюжка, а потім — у плазматичну мембрану в ряді випадків шляхом злиття з нею везикул комплексу Гольджі. Такий цілеспрямований транспорт здійснюється завдяки наявності на аминоконці білка специфічної послідовності з 20—30 амінокислот (сигнального пептида). Сигнальний пептид відрізається від білкової молекули після того, як глікопротеїд досягає плазматичної мембрани.

Гликозилювання поліпептидів є складним багатоступінчастим процесом, перші етапи якого починаються вже в процесі синтезу поліпептидів, і перший цукор приєднується до поліпептидного ланцюга, який ще не зійшов з рибосоми. Наступні етапи гликозилювання відбуваються шляхом послідовного приєднання цукрів у вигляді блоків до вуглеводного ланцюжка в процесі транспорту поліпептиду до плазматичної мембрани. Остаточне формування вуглеводного ланцюжка може завершуватися на плазматичній мембрані перед зборкам вірусної частки. Процес гликозилювання не впливає на транспорт поліпептиду до плазматичної мембрани, але має істотне значення для експресії біологічної активності білка. При пригнічення гликозилювання відповідними інгібіторами (аналоги цукрів типу 2-дезоксиглюкози, антибіотик тунікаміцин) порушується синтез поліпептидів, блокується зборка віріонів міксовірусів, рабдовірусів, альфа-вірусів або утворюються неінфекційні віріони герпеса й онковірусів.

Сульфування. Деякі білки складно влаштованих РНК- і ДНК-вмісних вірусів сульфуються після трансляції. Найчастіше сульфування зазнають глікопротеїди, при цьому сульфатна група зв'язується із цукровим компонентом глікопротеїда.

Ацилювання. Ряд глікопротеїдів складно влаштованих РНК-вмісних вірусів (НА2 вірусу грипу, білок у вірусу везикулярного стоматиту, білок НЙ вірусу ньюкаслської хвороби й ін.) містять ковалентно зв'язані 1—2 молекули жирних кислот.

Нарізування. Багато вірусних білків і в першу чергу глікопротеїди здобувають функціональну активність лише після того, як відбудеться їхнє нарізування в специфічних точках протеолітичними ферментами. Нарізування відбувається або з утворенням двох функціональних білкових субодиниць (наприклад, більша й мала субодиниці гемаглютиніна вірусу грипу, два глікопротеїда, Ег і Ез, вірусу лісу Семлікі) або з утворенням одного функціонально активного білка й неактивного фрагмента, наприклад білки Б и НІ параміксовірусів. Нарізування звичайно здійснюється клітинними ферментами. У багатьох складно влаштованих вірусів тварин, що мають глікопротеїд, нарізування необхідне для формування активних прикріпних білків і білків злиття й, отже, для придбання вірусом здатності інфікувати клітину. Лише після нарізування цих білків вірусна частка здобуває інфекційну активність. Таким чином, можна говорити про протеолітичну активацію ряду вірусів, здійснювану за допомогою клітинних ферментів.

Фосфорилювання. Фосфопротеїди містяться практично в складі всіх вірусів тварин, РНК- і ДНК-вмісних, просто й складно влаштованих. У складі більшості вірусів виявлені протеїнкінази, однак фосфорилювання може здійснюватися як вірусними, так і клітинними ферментами. Звичайно фосфорилюються білки, пов'язані з вірусним геномом, що здійснюють регулюючу роль у його експресії. Одним із прикладів є фосфорилювання білка онкогенних вірусів, що обумовлює клітинну трансформацію. Цей білок є продуктом гена 18гс і одночасно протеїнкіназою і фосфопротеїдом, тобто здатний до самофосфорилювання.

Із процесом фосфорилювання пов'язаний механізм антивірусної дії інтерферону. У заражених вірусом клітинах інтерферон індукує синтез протеїнкінази, яка фосфорилює субодиницю ініціюючого фактора трансляції ЕІФ-2, у результаті чого блокується трансляція вірусних інформаційних РНК. Фосфорилювання білків відіграє регулюючу роль у транскрипції й трансляції вірусних іРНК, специфічному впізнаванні вірусних іРНК рибосомою, білок-нуклеїновому і білок-білковому впізнаванні на стадії зборка вірусних часток.

Реплікація

Реплікацією називається синтез молекул нуклеїнової кислоти, гомологічних геному. У клітині відбувається реплікація ДНК, у результаті якої утворюються дочірні двониткові ДНК. Реплікація відбувається на розплетених ділянках ДНК і йде одночасно на обох нитках від 5'-кінця до З'-кінця. Оскільки дві нитки ДНК мають протилежну полярність 5'-3' і 3'-5', а ділянка реплікації («виделка») рухається в одному напрямку, один ланцюг будується у зворотному напрямку окремими фрагментами, які називаються фрагментами Оказакі ( по імені вченого, що вперше запропонував таку модель). Після синтезу фрагменти Оказакі «зшиваються» лігазою у єдину нитку.

Реплікація ДНК здійснюється ДНК-полімеразами. Для початку реплікації необхідний попередній синтез короткої ділянки РНК на матриці ДНК, який називається затравкою. Із затравки починається синтез нитки ДНК, після чого РНК швидко видаляється зі зростаючої ділянки.

Реплікація вірусних ДНК. Реплікація генома ДНК-вмісних вірусів в основному каталізується клітинними фрагментами й механізм її подібний з механізмом реплікації клітинної ДНК.

Кожна вдруге синтезована молекула ДНК складається з однієї батьківської й однієї вдруге синтезованої нитки. Такий механізм реплікації називається напівконсервативним.

У вірусів, що містять кільцеві двониткові ДНК ( паповавіруси), розрізається одна з ниток ДНК, що веде до розкручування супервитків на певній ділянці молекули.

При реплікації однонитчатих ДНК (сімейство парвовірусів) відбувається утворення двонитчатих форм, які являють собою проміжні реплікативні форми.

Реплікація вірусних РНК. У клітині немає ферментів, здатних здійснити реплікацію РНК. Тому ферменти, що беруть участь в реплікації, завжди вірусоспецифічні. Реплікацію здійснює той же фермент, що й транскрипцію; репліказа є або модифікованою транскриптазою, або при реплікації відповідним чином модифікується матриця.

Реплікація однонитчатих РНК здійснюється у два етапи: спочатку синтезуються комплементарні геному нитки, які у свою чергу стають матрицями для синтезу копій генома. У «мінус-ниткових» вірусів перший етап реплікації — утворення комплементарних ниток подібний із процесом транскрипції. Однак між ними є істотна відмінність: якщо при транскрипції зчитуються певні ділянки генома, то при реплікації зчитується весь геном. Наприклад, іРНК параміксовірусів і рабдовірусів є короткими молекулами, комплементарними різним ділянкам генома, а іРНК вірусу грипу на 20—30 нуклеотидів коротше кожного фрагмента генома. У той же час матриці для реплікації є повною комплементарною послідовністю генома й називаються антигеномом.

У заражених клітинах існує механізм перемикання транскрипції на реплікацію. У «мінус-ниткових» вірусів цей механізм обумовлений маскуванням ділянок термінації транскрипції на матриці генома, у результаті чого відбувається наскрізне зчитування генома. Ділянки термінації маскуються одним з вірусних білків.

При реплікації зростаюча « плюс-нитка» витісняє синтезовану раніше «плюс-нитку» або двоспіральна матриця консервується. Більш розповсюджений перший механізм реплікації.

Реплікативні комплекси. Оскільки утворені нитки ДНК і РНК якийсь час залишаються пов'язаними з матрицею, у зараженій клітині формуються реплікативні комплекси, у яких здійснюється весь процес реплікації (а в ряді випадків також і транскрипції) генома. Реплікативний комплекс містить геном, репліказу й пов'язані з матрицею вдруге синтезовані ланцюги нуклеїнових кислот. Вдруге синтезовані геномні молекули негайно асоціюються з вірусними білками, тому в реплікативних комплексах виявляються антигени. У процесі реплікації виникає частково двонитчата структура з однонитковими «хвостами», так званий реплікативний попередник (РП).

Реплікативні комплекси асоційовані із клітинними структурами або з передіснуючими, або вірусіндукованими. Наприклад, реплікативні комплекси пікорнавірусів асоційовані з мембранами ендоплазматичної сітки, вірусів віспи — із цитоплазматичним матриксом, реплікативні комплекси аденовірусів і вірусів герпеса в ядрах знаходяться в асоціації із вдруге сформованими волокнистими структурами й пов'язані з ядерними мембранами. У заражених клітинах може відбуватися посилена проліферація клітинних структур, з якими зв'язані реплікативні комплекси, або їх формування із передіснуючого матеріалу. Наприклад, у клітинах, заражених пікорнавірусами, відбувається проліферація гладких мембран. У клітинах, заражених реовірусами, спостерігається скупчення мікротрубочок; у клітинах, заражених вірусами віспи, відбувається формування цитоплазматичного матрикса.

У реплікативних комплексах одночасно із синтезом геномних молекул здійснюється транскрипція й відбувається зборка нуклеокапсидів і серцевин, а при деяких інфекціях — і вірусних часток. Про складну структуру реплікативних комплексів говорить, наприклад, такий склад реплікативного комплексу аденовірусів: однониткові ДНК, однониткові РНК, ферменти реплікації й транскрипції, структурні й неструктурні вірусні білки й ряд клітинних білків.

Регуляція реплікації. Вдруге утворена молекула геномної РНК може бути використана різним образом. Вона може асоціюватися з капсидними білками та ввійти до складу віріона, служити матрицею для синтезу нових геномних молекул, або — для утворення іРНК, нарешті, в «плюс-ниткових» вірусів вона може виконувати функції іРНК і зв'язуватися з рибосомами. У клітині існують механізми, що регулюють використання геномних молекул. Регуляція йде за принципом саморегуляції й реалізується шляхом взаємодії вірусних РНК і білків завдяки можливості білок-нуклеїнового і білок-білкового впізнавання. Наприклад, роль термінального білка пікорна-вірусів полягає в забороні трансляції іРНК і відборі молекул для формування віріонів. Білок, що зв'язується з 5'-кінцем геномної РНК, у свою чергу впізнається капсидними білками й служить сигналом для зборка вірусної частки за участю даної молекули РНК. За тим же принципом відбираються геномні молекули РНК у «мінус-ниткових» вірусів: до З'-кінця геномних РНК приєднується молекула капсидного вірусного білка, до якої підбудовуються інші білкові субодиниці в результаті білок-білкового впізнавання, і така молекула РНК ввійде до складу віріона або послужить матрицею для реплікації. Для перемикання її на транскрипцію повинна виникнути заборона білок-нуклеїнової взаємодії. У реплікації ДНК аденовірусів бере участь молекула білка, яка зв'язується з кінцем вірусної ДНК і необхідна для початку реплікації. Таким чином, для початку реплікації необхідний синтез вірусних білків: у присутності інгібіторів білкового синтезу відсутнє перемикання транскрипції на реплікацію.

Зборка вірусних часток

Синтез компонентів вірусних часток у клітині роз'єднаний і може протікати в різних структурах ядра й цитоплазми. Віруси, реплікація яких проходить у ядрах, умовно називають ядерними. В основному це ДНК-вмісні віруси: аденовіруси, паповавіруси, парвовіруси, віруси герпеса. Віруси, що реплікуються в цитоплазмі, називають цитоплазматичними. До них відносяться із ДНК-вмісних вірус віспи й більшість РНК-вмісних вірусів, за винятком ортоміксовірусів і ретровірусів. Однак цей поділ досить відносний, тому що в репродукції тих і інших вірусів є стадії, що протікають відповідно в цитоплазмі і ядрі.

Всередині ядра й цитоплазми синтез вірусоспецифічних молекул також може бути роз'єднаний. Так, наприклад, синтез одних білків здійснюється на вільних полісомах, а інших — на полісомах, пов'язаних з мембранами. Вірусні нуклеїнові кислоти синтезуються в асоціації із клітинними структурами далеко від полісом, які синтезують вірусні білки. При такому диз’юнктивному способі репродукції утворення вірусної частки можливо лише в тому випадку, якщо вірусні нуклеїнові кислоти й білки мають здатність при достатній концентрації впізнавати один одного в різноманітті клітинних білків і нуклеїнових кислот і мимовільно з'єднуватися один з одним, тобто здатні до зборки.

В основі самозборки лежить специфічне білок-нуклеїнове й білок-білкове впізнавання, яке може відбуватися в результаті гідрофобних, сольових і водневих зв'язків, а також стеричної відповідності. Білок-нуклеїнове впізнавання обмежене невеликою ділянкою молекули нуклеїнової кислоти й визначається унікальними послідовностями нуклеотидів в некодуючій частині вірусного генома. Із цього впізнавання ділянки генома вірусними капсидними білками починається процес зборки вірусної частки. Приєднання інших білкових молекул здійснюється за рахунок специфічних білок-білкових взаємодій або неспецифічних білок-нуклеїнових взаємодій.

У зв'язку з різноманітністю структури вірусів тварин різноманітні й способи формування віріонів, однак можна сформулювати наступні загальні принципи зборки.

1. У просто влаштованих вірусів формуються провіріони, які потім у результаті модифікацій білків перетворюються у віріони. У складно влаштованих вірусів зборка здійснюється багатоступінчасто. Спочатку формуються нуклеокапсиди або серцевини, з якими взаємодіють білки зовнішніх оболонок.

2. Зборка складно влаштованих вірусів ( за винятком зборки вірусів віспи й реовірусів) здійснюється на клітинних мембранах. Зборка ядерних вірусів відбувається за участю ядерних мембран, зборка цитоплазматичних вірусів — за участю мембран ендоплазматичної сітки або плазматичної мембрани, куди незалежно друг від друга прибувають усі компоненти вірусної частки.

3. У ряду складно влаштованих вірусів існують спеціальні гідрофобні білки, що виконують функції посередників між сформованими нуклеокапсидами й вірусними оболонками. Такими білками є матриксні білки у ряду «мінус-ниткових» вірусів (ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів).

4. Зборка нуклеокапсидів, серцевин, провіріонів і віріонів відбувається не у внутрішньоклітинній рідині, а в спеціальних структурах, передіснуючих у клітині або індукованих вірусом («фабриках»).

5. Складно влаштовані віруси для побудови своїх часток використовують ряд елементів клітини-хазяїна, наприклад ліпіди, деякі ферменти, у ДНК-геномного БУ40 — гістони, в оболонкових РНК-геномних вірусів — актин, а в складі ареновірусів виявлені навіть рибосоми. Клітинні молекули несуть певні функції у вірусній частці, однак включення їх у віріон може з'явитися й наслідком випадкової контамінації, як, наприклад, включення ряду ферментів клітинних оболонок або клітинних нуклеїнових кислот.

Зборка РНК-вмісних вірусів. Зборка просто влаштованих РНК-вмісних вірусів полягає в асоціації вірусного генома з вірусними капсидними білками з утворенням нуклеокапсида.

У складно влаштованих РНК-вмісних вірусів процеси зборки нуклеокапсидів, серцевин і зрілих віріонів звичайно роз'єднані. Нуклеокапсиди мігрують до місця зборки вірусних часток — плазматичної мембрани (або мембранам ендоплазматичної сітки) і впорядковано вибудовуються під ділянками мембран, із зовнішньої сторони яких уже вбудовані вірусні суперкапсидні білки. Зборка полягає в тому, що ділянки, які містять глікопротеїди з пов'язаними з ними нуклеокапсидами, поступово вип’ячуються крізь модифіковану клітинну мембрану. У результаті випинання утворюється «брунька», що містить нуклеокапсид і оболонку із суперкапсидними білками. «Брунька» відділяється від клітинної мембрани з утворенням вільної вірусної частки. Такий спосіб формування вірусних часток називається брунькуванням. Брунькування може відбуватися - крізь плазматичну мембрану клітини в зовнішнє середовище, як в ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів і альфа-вірусів, або через мембрани ендоплазматичної сітки у вакуолі, як у аренавірусів і буньявірусів. В основі випинання бруньки через мембрану лежать звичайні клітинні процеси, спрямовані на відторгнення непридатного для клітини матеріалу й відновлення мембран. Ділянка майбутньої бруньки містить фіксований нуклеокапсид, асоційований із суперкапсидними білками, але рух мембранних ліпідів триває в силу їх плинності, ліпіди обволікають майбутню бруньку й разом з ними з «бруньки» витісняються клітинні мембранні білки. У результаті цього руху відбувається набухання «бруньки» над клітинною мембраною. Механізм утворення «бруньки» пояснює, чому в складі вірусів, що брунькуються, не міститься клітинних мембранних білків.

Усі вірусні компоненти — нуклеокапсиди й суперкапсидні білки прибувають до місця зборки незалежно один від одного. Першими до місця зборки прибувають суперкапсидні білки. Звичайно цими білками є глікопротеїди, які синтезуються в полісомах, пов'язаних з мембранами, і через шорсткуваті, а потім гладкі мембрани в результаті злиття з ними везикул комплексу Гольджі транспортуються на зовнішню поверхню плазматичних мембран або залишаються в складі везикул.

Включення глікопротеїдов у певні зони клітинних мембран призводить до модифікацій мембран. Нуклеокапсид впізнає ці ділянки й підходить до них із внутрішньої сторони ліпідного бішару. Впізнавання здійснюється за допомогою одного із двох механізмів: 1) нуклеокапсид взаємодіє з ділянкою глікопротеїда, що пронизує клітинну мембрану й виходить на її внутрішню поверхню. Такий механізм має місце у альфа-вірусів; гідрофобний фрагмент глікопротеїда Е1 проникає крізь ліпідний шар на його внутрішню поверхню, і із цим фрагментом зв'язуються нуклеокапсиди, які пізніше увійдуть до складу «бруньки»; 2) у зборку включається ще один вірусний білок, що є медіатором зборки, який називається мембранним, або матриксним білком. М-білок синтезується на вільних полісомах, але відразу після синтезу вбудовується в клітинні мембрани із внутрішньої цитоплазматичної сторони ліпідного бішару. Цей білок високо гідрофобний і тому здатний до білок-білкових і білокліпідних взаємодій.

Включення М-білка в клітинні мембрани є сигналом для зборки вірусної частки: слідом за включенням негайно слідує зв'язування нуклеокапсидів з мембранами й брунькування вірусної частки. Тим самим М-Білок виконує функцію фактора, що лімітує зборку.

Зборка ДНК-вмісних вірусів. У зборці ДНК-вмісних вірусів є деякі відмінності від зборки РНК-вмісних вірусів. Як і в РНК-вмісних вірусів, зборка ДНК-вмісних вірусів є багатоступінчастим процесом з утворенням проміжних форм, що відрізняються від зрілих віріонів за складом поліпептидів. Перший етап зборки полягає в асоціації ДНК із внутрішніми білками й формуванні серцевин або нуклеокапсидів. При цьому ДНК з'єднується з попередньо сформованими «порожніми» капсидами.

У результаті зв'язування ДНК із капсидами з'являється новий клас проміжних форм, які називаються неповними формами. Крім неповних форм із різним змістом ДНК, існує інша проміжна форма в морфогенезі — незрілі віріони, що відрізняються від зрілих тим, що містять ненарізані попередники поліпептидів. Таким чином, морфогенез вірусів тісно пов'язаний з модифікацією (процесингом) білків.

Зборка ядерних вірусів починається в ядрі, звичайно — з асоціації з ядерною мембраною. Проміжні форми вірусу герпеса, що формуються в ядрі, брунькуються в перинуклеарний простір крізь внутрішню ядерну мембрану, і вірус здобуває таким шляхом оболонку, яка є дериватом ядерної мембрани. Подальше добудування й дозрівання віріонів відбувається в мембранах ендоплазматичної сітки й в апараті Гольджі, звідки вірус у складі цитоплазматичних везикул транспортується на клітинну поверхню.

У ліпідовмісних вірусів, які не брунькуються – вірусів віспи – зборка віріонів відбувається в уже описаних цитоплазматичних вірусних «фабриках». Ліпідна оболонка вірусів в «фабриках» формується із клітинних ліпідів шляхом автономної зборки, тому ліпідний склад оболонок значно відрізняється від складу ліпідів у клітинних мембранах.

Вихід вірусних часток із клітини

Існують два способи виходу вірусного потомства із клітини: 1) шляхом «вибуху»; 2) шляхом брунькування.

Вихід із клітини шляхом вибуху пов'язаний з деструкцією клітини, порушенням її цілісності, у результаті чого вірусні зрілі частки, що перебувають усередині клітини, виходять в навколишнє середовище. Такий спосіб виходу з клітини властивий вірусам, що не містять ліпопротеїдної оболонки (пікорна-, рео-, парво-, папова-, аденовіруси). Однак деякі із цих вірусів можуть транспортуватися на клітинну поверхню до загибелі клітини.

Вихід із клітин шляхом брунькування властивий вірусам, що містять ліпопротеїдну мембрану, яка є дериватом клітинних мембран. При цьому способі клітина може тривалий час зберігати життєздатність і продукувати вірусне потомство, поки не відбудеться повне виснаження її ресурсів.