Тема 6. Інтерференція вірусів.

Клітини, які продукують ретровірус, стають стійкими до наступного зараження цим же вірусом або іншим, але використовуючим ті ж клітинні рецептори для проникнення в клітину. Це явище називають вірусною інтерференцією. Вторинного зараження не відбувається тому, що синтезовані в клітині вірусні поверхневі глікопротеїни блокують специфічні клітинні рецептори. Оскільки цей вид резистентності залежить від клітинних рецепторів, віруси, що зв'язуються з іншими рецепторами, легко заражають уже заражені клітини. Тому вірусна інтерференція служить відмінним тестом при визначенні й класифікації глікопротеїна даного вірусу.

Інтерференція дозволяє також визначати, чи використовують два віруси з однакової тропністю (екотропні і т.д.) ті самі або різні клітинні рецептори. Саме завдяки використанню цього тесту з'ясоване, що амфотропні MuLV підрозділяються на два класи: саме амфотропні віруси й віруси, названі MCF (від англ. mink cell focus-forming - утворюючі фокуси на клітинах норки). Вірусна інтерференція показала, що екотропні, ксенотропні, амфотропні й MCF-віруси входять у клітину через різні рецептори. Ці дані узгодяться з результатами аналізу гена env іншими методами. Наприклад, сироватка, що нейтралізує віруси одного класу, звичайно вибірково нейтралізує інші віруси того ж класу. Крім того, і самі гени env і їх продукти більш подібні у вірусів одного класу.

Тема 7. Культивування вірусів різних груп.

Культури клітин

З появою методу культури клітин лабораторна діагнос­тика вірусних інфекцій за своєю ефективністю піднялася на новий, якісно вищий щабель. Відкриття антибіотиків, кон­струювання штучних поживних середовищ для культиву­вання клітин in vitro та їх промислове виробництво, поява банків клітинних культур створили оптимальні умови для впровадження методів клітинних культур у практичну ві­русологічну лабораторію для виділення вірусів із клінічного матеріалу та ідентифікації їх.

Сучасну практичну вірусологічну лабораторію важко уявити без клітинних культур різного походження. Проте достатньо мати в лабораторії лише кілька ліній клітин, що характеризувалися б високою чутливістю до найбільш по­ширених вірусів і невибагливістю до умов культивування. Як правило*, до цього обмеженого числа клітинних культур входять клітини епітеліального походження та фібробластоподібні лінії. Із епітеліальних клітинних ліній йдеться про первинно-трипсинізовані культури нирок мавп, поросят, ем­бріонів людини та ін. Із перещеплюваних клітин доцільно рекомендувати такі відомі лінії, як Неlа, Нер-2, Vего, Rh тощо. Можна доповнити вказаний реєстр клі­тинних ліній первинно-трипсинізованою культурою фібро­бластів ембріонів курки або диплоїдною лінією МРС.

Лабораторну діагностику вірусних інфекцій з викорис­танням методу клітинних культур звичайно проводять у два етапи. На першому етапі доводять вірусну природу захворювання шляхом індикації (виявлення) та виділення вірусу з клінічного матеріалу. На другому — ідентифіку­ють виділений агент. Найчастіше вірус виявляють за спри­чинюваною ним цитопатичною дією (ЦПД) у кліти­нах, що вирощують у моношарах. Всі відомі типи ЦПД буде описано далі. У цілій низці випадків для встановлен­ня етіологічного діагнозу досить наявності характерної ЦПД. Наприклад, у багатьох лабораторіях, де здійснюють діагностику герпетичної інфекції статевих органів, проводять інфікування клітинних культур фібробластів курячого ембріона клінічним матеріалом від хворих і за­значають у звіті, що «виявлено ознаки ЦПД, властиві вірусові герпесу другого типу». Ідентифікацію виділеного аген­та у такому випадку не проводять, оскільки першої інфор­мації цілком досить, щоб вона разом із даними клінічного обстеження допомогла лікарю у визначенні справжнього діагнозу. В інших випадках, коли ознаки ЦПД характери­зують велику групу вірусів (наприклад, коли йдеться про ентеровіруси), обов'язково треба проводити ідентифікацію виділеного агента у реакції нейтралізації із типоспецифічними сироватками. При цьому слід брати до уваги, що реакція з метою ідентифікації виділеного агента потребує багато часу, іноді до 2—3 тижнів. Тому попередні дані можна надсилати у клініку в такому вигляді: «Виділено ентеровіруси, потрібна подальша ідентифікація».

Міксо- і параміксовіруси звичайно в найбільш викорис­товуваних клітинних культурах не спричинюють форму­вання ЦПД, проте здатні таким чином змінити поверхню клітин у культурі, що ті починають адсорбувати на собі еритроцити. Наприклад, клінічний матеріал інкубують з клітинами моношарової культури, потім клітини відми­вають і вносять суспензію еритроцитів морської свинки або еритроцити людини, яка має 0 групу крові. Після пев­ної інкубації з еритроцитами клітини знову відмивають і проводять облік результатів реакції гемадсорбції. Наступ­ну ідентифікацію здійснюють за допомогою реакції галь­мування гемадсорбції специфічними сироватками.

Деякі міксо- та параміксовіруси здатні виділяти у культуральне середовище розчинний гемаглютинін, тому їх ідентифікацію можна проводити в реакції гальмування гемаглютинації.

Цілий ряд вірусів, що виділяються у клітинних культурах, ідентифікують методами імунофлюоресценції. Про­те, коли складається ситуація, за якої клінічна картина захворювання та характер ЦПД не дають змоги остаточно зарахувати виділений вірус до тієї або іншої групи (ро­дини), слід зробити клітинний гомогенат і дослідити його під електронним мікроскопом. Подібним чином час від часу належить досліджувати і клітинні культури, що вико­ристовуються у повсякденній практиці, для контролю їх випадкової контамінації якимись вірусами внутрішньо-лабораторно.

Одержання культур клітин

Для виділення і типування вірусів використовують культури органів і завислих клітин (у суспензії), або моношарові культури. Робота з культурами клітин, незалежно від того, яку систему вирощування клітин при цьому застосовують, може бути ефективною тільки за умов до­тримання стерильності, засвоєння методик обробки посуду і гумових виробів, хорошої якості живильних середовищ і сольових розчинів.

Живильні середовища та розчини. Живильні середови­ща для одержання культур клітин можуть бути ростовими та підтримувальпими. Ростові середовища, або середовища росту, містять поряд з іншими компонентами 5—15 % си­роватки крові тварин і сприяють розмноженню клітин, швидкому росту й формуванню моношарових культур. Для виживання клітин у вже сформованому моношарі використовують підтримувальне середовище, де міститься близько 2 % сироватки крові тварин.

За походженням живильні середовища бувають при­родні й синтетичні.

Природні живильні середовища — це рідини із сероз­них порожнин, екстракти тканин, продукти гідролізу моло­ка, гемогідролізати тощо. Усі вони ідентичні середовищу, в якому існують клітини в організмі. Недоліком природних живильних середовищ є неможливість створення контро­льованих стандартних умов, що пов'язане з варіюючою кількістю живильних компонентів, які входять до їх складу.

Синтетичні живильні середовища, що мають точний хімічний склад, одержують штучно, шляхом додавання до сольових розчинів амінокислот і вітамінів.

Антибіотики. Успішне культивування клітин можливе тіль­ки за умов дотримання асептики. Для того щоб запобігти росту бактерій та плісеневих грибів, використовують анти­біотики. Звичайно обмежуються застосуванням пеніциліну (натрієва сіль бензилпеніциліну) та стрептоміцину (хлор­кальцієвий комплекс), котрі вносять у живильні середови­ща і сольові розчини безпосередньо перед вживанням: 100 ОД/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Можна використовувати також гентаміцин (200 ОД/мл), канамі-цин і лінкоміцин (100 ОД/мл), неоміцин (50 ОД/мл), амфотерицин В, або фунгізон (5 ОД/мл), ністатин (50 ОД/мл).

Первинні культури клітин

Первинні культури клітин одержують із тканин люди­ни або тварин шляхом їх ферментативної дезинтеграції. Ці культури клітин можуть зазнавати близько 10 поділів. Первинні культури клітин високочутливі до бага­тьох вірусів, онкогенно безпечні, їх можна одер­жати у великій кількості, а це є важливим для проведення лабораторних досліджень. Вадою таких культур вважаєть­ся значна трудомісткість і тривалість одержання, а також можлива контамінація латентними вірусами.

Нині для одержання культур клітин широко застосо­вують методи ферментативної дезинтеграції з використан­ням холодного або теплого трипсину.

Метод з використанням теплого трипсину полягає в тому, що шматочки тканини або цілі органи ембріона вміщу­ють у 0,25 % розчин трипсину при температурі 37 °С. Під час піпетування у теплому трипсині або перемішування шматочків тканин у трипсині на магнітній мішалці відбу­вається їх дезагрегація на окремі клітини. Порції клітин збирають у міру їх виділення, центрифугують, трипсин зливають, вносять в середовище росту і суспендують у ньому клітини. Принцип методу використання холодного трипсин)' полягає в тому, що шматочки тканин заливають 0,25 % роз­чином трипсину і залишають на ніч при температурі 4 °С. Потім розчин трипсину із шматочками тканин підігрівають до 37 °С, витримують кілька хвилин і швидко піпетують; суспензію центрифугують, трипсин зливають, клітини по­вільно піпетують у середовищі росту і визначають їх кіль­кість у лічильній камері Горяєва

Методика приготування одношарової культури фібро­бластів курячого ембріона. Яйце вміщують у штатив тупим кінцем догори, шкаралупу протирають спиртом, обпалюють, надламують і зрізують. Пінцетом за шийку виймають ем­бріон і вміщують у чашку Петрі (після кожної маніпуля­ції інструменти обробляють спиртом і обпалюють). Вида­ляють голову і нутрощі, переносять тушку ембріона в чаш­ку Петрі й промивають стерильним розчином Хенкса з антибіотиками. Промивши, ембріон подрібнюють на шматоч­ки розміром 2—3 мм і переносять їх у колбу з розчином трипсину. Витримують протягом 20—30 хв, слабо перемі­шуючи на магнітній мішалці при кімнатній температурі. Через кожні 20 хв завись клітини зливають у центрифуга­льні пробірки.

До тканини, що залишилася, додають роз­чин Хенкса і знову вміщують на магнітну мішалку для по­дальшої дезагрегації клітин. Процедуру повторюють до повного розщеплення тканини. Одержану суспензію клітин центрифугують на швидкості 1500—3000 об/хв протягом 7—10 хв, трипсин зливають, а клітини суспендують у середовищі росту. Потім суспензію фільтрують, використовуючи лійку з марлевим фільтром, підраховують кількість клітин, розводять середовищем росту до необхідної для посіву кон­центрації та розливають у пробірки, матраци або планшети для культивування. Загальний вигляд первинно-трипсинізованої культури фібробластів курячого ембріона подано на мал. 6.

Для визначення кількості клітин у суспензії необхідно. 1) притиснути покривне скло до лічильної камери до появи кілець інтерференції з обох боків; 2) розвести суспензію клітин 0,2 % розчином трипанового синього (1:5); 3) ко­ристуючись стерильною піпеткою, асептично набрати сус­пензію клітин і, торкаючись краю покривного скла, дати краплі заповнити простір між покривним склом і лічиль­ною камерою; 4) підрахувати під мікроскопом (об'єктив 20Х, окуляр 10Х) усі клітини у 25 великих квадратах, включаючи й ті, що містяться на верхній та лівій межі кож­ного квадрата; 5) одержану кількість помножити на роз­ведення (1:5), об'єм суспензії та на постійну величину (10 000).

Американської ко­лекції типових культур АТСС). Кожну клітинну лінію, ще отримує лабораторія, має супроводжувати свій паспорт, де подається така необхідна інформація:

1. Назва клітинної лінії, рік її одержання, автор.

2. Тканина або орган, з яких клітинна лінія походить.

3. Морфологія культури.

4. Середовище для культивування.

5. Посівна концентрація клітин на 1 мл середовища.

6. Рекомендована кратність пересівання.

7. Метод зняття клітин із скла або іншого субстрату.

8. Частота пересівання.

1. Середовище, що захищає клітини під час їх консер­вування методом заморожування.

10. Виживання клітин після розморожування, відсоток живих клітин від усієї замороженої популяції.

11. Контамінанти.

12. Чутливість до вірусів.

13. Ізоферменти культури.

14. Середовище підтримки (середовище, де клітини не діляться, але зберігають свою життєздатність).

Нижче наводимо конкретний приклад такого доку­мента:

1. Культура клітин 4647; 1974 рік, Л. Л. Миронова та співавтори.

2. Нирки дорослої зеленої мавпи.

3. Культура складається з епітеліальних клітин.

4. Середовище Ігла — 90 % або суміш середовища Ігла з 0,25 % розчином гідролізату лактальбуміну в рівних пропорціях, сироватка крові великої рогатої худоби — 10%.

5. 50ХЮ00, 25ХЮ00, 13ХЮ00, 7ХЮ00, ЗХЮ00 на 1 мл.

5. 1:2.

5. 0,25 % трипсин для культури клітин.

6. Кожні 4 дні.

9. Середовище Ігла — 80%, сироватка великої рога­ тої худоби — 10 %, гліцерин — 10 %.

10. 84 %.

9. Бактерії, гриби, мікоплазма; віруси не виявлено.

9. Культура чутлива до ентеро-, арена-, флаві-, лейко-, параміксо-, рабдо-, аденовірусів.

10. Клітини мають Г-6-ФДГ та ЛДГ.

14. Середовище Ігла, Ігла МЕМ, 199, ГЛАХІ. Перещеплювані культури клітин вирощують у вигляді суспензій (із стаціонарною або проточною системою по­давання живильного середовища) або одношарових куль­тур на поверхні скла в посудинах, матрацах, пробірках, панелях. В останньому випадку необхідне систематичне проведення пасажів (посіви) клітин, використовуючи для цього культури попереднього пасажу або музейні клітини, що зберігаються в умовах консервації. Повноцінну по­пуляцію клітин можна одержати лише за умови викорис­тання життєздатних клітин.

Для пересівання відбирають культури з чіткими межами між клітинами, що мають типову морфологію. Наявність у полі зору великої кількості округлих клітин, поява клітин з вакуолями, включеннями та іншими ознаками патології роблять дану генерацію непридатною для пересівання. Допускається невелика кількість округлих клітинних елементів, які при незначному струшуванні змиваються з поверхні моношару і не впливають на його придатність до пересівання. Під час росту клітин (на 6— 7-му добу) спостерігається зміна рН у кислий бік, при цьому іноді частина клітин відривається від поверхні скла і потрапляє у живильне середовище. Значне скаламутнення культуральної рідини може бути наслідком бактеріальної контамінації та свідчити про необхідність відповідного контролю.

Відібрану для пересівання культуру клітин відокремлюють від скла за допомогою трипсину (0,25 %), версену (0,2 %), хімопсину (0,02 %) або механічно, зішкрібаючи та подрібнюючи одержані клітини за допомогою багаторазового піпетування. У разі використання версену відокремлення клітин від скла і формування суспензії відбувається при кімнатній температурі за 5—10 хв (по-різному для різних культур). Якщо розпушення шару клітин достатнє і почалося відокремлення його від скла, розчин версену зливають, а в матраци заливають мірну кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини із скла посудини. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічильній камері Горяєва розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. У флакони місткістю 100 мл розливають по 20 мл зависі, що містить 40—60 тис. клітин в 1 мл, у матраци місткістю 1,5 л вносять по 150 мл зависі, в 1 мл якої міститься 60—70 тис. клітин. У пробірки вносять по 180—300 тис. клітин в об'ємі 1 мл. Формування моношару клітин відбувається за 48 год.

Цитопатична дія вірусів у культурах клітин

Різні віруси спричиняють неоднакові зміни у клітинах. Морфологічні зміни, що виникають під час взаємодії вірусу і клітини, називають цитопатичною дією (ЦПД), а віруси, які стають причиною цих змін,— цитопатогенними. Період розвитку і характер цитопатичних змін, спричинених цитопатогенними вірусами в інфікованих культурах клітин, визначаються: 1) властивостями вірусу;. 2) дозою вірусу; 3) властивостями клітин та умовами їх культивування.

Характерні для кожного вірусу цитопатичні зміни розвиваються в культурах клітин, заражених середніми дозами вірусу — 1000—10 000 ЦПД50*, за умови яких процес загибелі клітин розтягується (у часі. Якщо дози вірусу великі або малі, морфологічні зміни у клітинах бувають нетиповими: значні дози вірусів спричинюють розвиток некрозу з повним відшаруванням зруйнованих клітин від скла, а незначні — повільну осередкову дегенерацію клітин.

ЦПД50 — цитопатична доза вірусу, яка спричинює дегенерацію в 50 % пробірок із зараженою культурою клітин.

J.R. Enders (1954) виділив ряд морфологічних проявів вірусної цитопатогенності й запропонував класифіку­вати віруси на три групи: 1) ті, що спричиняють лише деге­нерацію клітин; 2) ті, що зумовлюють утворення внутріш­ньоклітинних (внутрішньоядерних і цитоплазматичних) включень і дегенерацію клітин (наприклад, вірус віс­пи), сі) ті, що формують багатоядерні клітини-синцитії та спричиняють дегенерацію клітин з утворенням або без утво­рення внутрішньоклітинних включень.

Виділяють три основні види змін у випадку заражен­ня культур клітин:

1. Утворення багатоядерних гігантських клітин, син-цитпв (мал. 10) і симпластів, що є результатом злиття цитоплазми багатьох клітин і амітотичного поділу

2. Круглоклітинна .дегенерація (пікноз, зморщування деструкція клітин), що виникає внаслідок втрати міжклі­тинних зв'язків (мал. 11, 12).

3. Розвиток осередків клітинної проліферації, що скла­даються з кількох шарів клітин.

Ступінь дегенерації клітин оцінюють знаком плюс-(4+)— деструкція всіх клітин (100%); (3+)—більшості клітин (75%); (2+) - половини клітин (50%);(+)—25% клітин; (±і)—окремих .клітин. (Відсутність дегенерації позначають знаком мінус.

Враховуючи ЦПД вірусів, слід пам'ятати про неспеци­фічну «вікову» дегенерацію клітин, яка спостерігається у старіючих культурах, а також про дегенерацію, зумовле­ну токсичною дією інокульованого матеріалу. Для виклю­чення токсичної дегенерації клітин проводять додатковий пасаж: по 0,2 мл культуральної рідини з пробірок з деге-нерованими клітинами вносять у пробірки із свіжими культурами клітин. Якщо дегенерація була зумовлена ток­сичним фактором випробовуваного матеріалу, то ЦПД у культурі клітин не розвивається.

Внутрішньоклітинні включення. Надзвичайно харак­терним для ЦПД багатьох вірусів є формування внутріш­ньоядерних і цитоплазматичних включень. Динаміка їх формування, їхні форма, розмір, субклітинна організація, наявність у них вірусспецифічних нуклеїнових кислот і білків мають важливе діагностичне значення, оскільки відрізняються у вірусів різних таксономічних груп.

Включення можна виявити в забарвлених або оброб­лених флюорохромами препаратах. Для цього культури клітин вирощують на скляних пластинках («літаюче скло») або пластинках з прозорої слюди, у пробірках або матрацах. Потім культури заражають вірусом, і через певні строки інкубації, залежно від властивостей інокульовано­го вірусу, готують препарати, забарвлюючи їх барвниками або флюорохромами.

Для вивчення включень можна приготувати відбитки органів і тканин, зскрібки клітин, гістологічні зрізи з ура­женої тканини. У наш час у зв'язку з трудомісткістю й три­валістю приготування препаратів метод гістологічних зрі­зів використовують для виявлення внутрішньоклітинних включень дуже рідко, здебільшого для діагностики сказу.

Забарвлення препаратів. Універсальним є забарвлення за Романовським — Гімзою у різних варіантах, під час якого виявляються всі види вірусних включень. Забарвле­ні за цим методом препарати фіксують у суміші Дюбоска—Бразіля—Буена (пікринова кислота — 1 г, 4 % фор­малін — 60 мл, 80% етиловий спирт—150 мл, крижана оцтова кислота — 15 мл). Препарати опускають у нерозве-дений розчин барвника Романовського — Гімзи на 10 хв, промивають дистильованою водою та висушують на по­вітрі. Після забарвлення за цим методом вірусні включен­ня стають рожевими або рожево-бузковими.

Забарвлення за Павловським. Препарати забарвлюють протягом 3—5 с барвником, виготовленим з 10 мл диетильованої води, 1 краплі насиченого спиртового розчину основного фуксину, 8 крапель водного або насиченого спиртового розчину метиленового синього. Барвник змива­ють проточною водою, і препарати висушують на повітрі.

Забарвлення за Селлером. Вологий мазок або відбиток без фіксування 10 с забарвлюють сумішшю з насичених розчинів у метиловому спирті основного фуксину (32 мл) і метиленового синього (15 мл), а також чистого метилового спирту (25 мл). Промивають проточною водою, сушать на повітрі, мікроскопують. Вірусні включення (тільця Бабеша—Негрі) забарвлюються у червоний колір, цитоплазма, ядра, ядерця — у синій, еритроцити —- у червоно-коричне­вий.

Забарвлення гематоксилін-еозином (оглядове гістоло­гічне): препарати фіксують на 5—10 хв у 70% та 96% етиловому спирті, промивають дистильованою водою, забарвлюють гематоксиліном Мейєра 3—5 хв, знову проми­вають дистильованою водою та 1—2 с витримують у 1 % водному розчині еозину. Потім препарати промивають ди­стильованою водою, роблять спиртову провідку (70 %, 96 % і абсолютні спирти, в кожному по 1—2 с) і освітлю­ють у ксилолі протягом 10—15 хв.

Забарвлення флюорохромами. Препарати фіксують у холодному ацетоні на 10—15 хв або у 70 % етиловому спирті —5 хв, потім у 96% етиловому спирті —3—5 хв. Після цього їх вміщують у водний розчин акридинового оранжевого (1 : 10 000) на 1—3 хв, промивають дистильо­ваною водою, сушать і досліджують під люмінесцентним мікроскопом, ДНК-вмісні структури дають зелене світіння, а РНК-вмісні — червоно-оранжеве.

Змістовний модуль ІІ. Екологічні проблеми вірусології.