53. Трансдукция

Общая (неспецифическая) трансдукция

Осуществляется фагом P1, существующим в бактериальной клетке в виде плазмиды, фагами P22 и Mu, встраивающимися в любой участок бактериальной хромосомы. После индуцирования профага с вероятностью в 10-5 на одну клетку возможна ошибочная упаковка фрагмента ДНК бактерии в капсид фага, ДНК самого фага в нём в этом случае нет. Длина этого фрагмента равна длине нормальной фаговой ДНК, его происхождение может быть любым: случайный участок хромосомы, плазмида, другие умеренные фаги.

Абортивная трансдукция

Попадая в другую бактериальную клетку, фрагмент ДНК может включаться в её геном, обычно путём гомологичной рекомбинации. Перенесённые фагом плазмиды способны замыкаться в кольцо и реплицироваться уже в новой клетке. В ряде случае фрагмент ДНК не встраивается в хромосому реципиента, не реплицируется, но сохраняется в клетке и транскрибируется. Это явление носит название абортивной трансдукции.

Специфическая трансдукция

Наиболее хорошо изучена специфическая трансдукция на примере фага ?. Этот фаг встраивается только в один участок (att-сайт) хромосомы E. coli с определённой последовательностью нуклеотидов (гомологичной att-участку в ДНК фага).

Для каждого специфически встраивающегося в хромосому умеренного фага характерен свой att-сайт и, соответственно, расположенные рядом с ним гены, которые он способен передавать. Ряд фагов может встраиваться в любое место на хромосоме и переносить любые гены по механизму специфической трансдукции. Кроме того, в хромосоме обычно есть последовательности, частично гомологичные att-участку ДНК фага. При повреждении полностью гомологичного att-сайта можно добиться включения фага в хромосому по этим последовательностям и передачу в ходе специфической трансдукции генов, соседних уже с ними.

Когда умеренный фаг, несущий бактериальные гены, встраивается в хромосому новой бактерии-хозяина, она содержит уже два одинаковых гена — собственный и принесённый извне. Поскольку фаг лишён части собственных генов, часто он не может индуцироваться и размножиться. Однако при заражении этой же клетки «вспомогательным» фагом того же вида, индуцирование дефектного фага становится возможным. Из хромосомы выходят и реплицируются как ДНК нормального «вспомогательного» фага, так и ДНК дефектного, вместе с переносимыми им бактериальными генами. Поэтому около 50% образующихся фаговых частиц несут бактериальную ДНК. Это явление носит название трансдукции с высокой частотой (HFT от англ. high frequency transduction).

54. Методы пенициллинового отборы и отпечатков

Часто для повышения вероятности выделения нужных мутантов используют пенициллиновый метод обогащения популяции бактерий мутантами. Этот метод был предложен в 1948 г. независимо Дж. Ледербергом и Б. Дэвисом для обогащения популяции бактерий ауксотрофными мутантами. Его можно применять по отношению ко всем видам бакте рий, чувствительным к пенициллину. Принцип метода основывается на том, что пенициллин лизирует растущие бактерии, но не повреждает бактерии, не способные к делению, например, такие, которые не размножаются из-за отсутствия в среде определенного фактора роста. Если смесь ауксотрофных и прототрофных бактерий инкубировать в минимальной среде, содержащей летальную дозу пенициллина, то прототрофные клетки будут погибать, так как они способны к делению, тогда как ауксотрофные мутанты, не способные к росту в этих условиях, вы живут и сохраняться, несмотря на присутствие в среде пенициллина. В результате такой обработки доля ауксотрофных клеток в популяции резко увеличивается относительно общего числа клеток. После обогащения популяции бактерий мутантными клетками их необходимо изолировать. Для этого суспензию бактерий освобождают от пенициллина путем центрифугирования и отмывания свежей средой или добавлением пенициллиназы, а затем высевают на полноценную питательную среду. Сформировавшиеся колонии методом отпечатков проверяют на способность к росту на минимальной среде. Клетки клонов, которые растут на полноценной среде, но не растут на минимальной, и являются ауксотрофными мутантами. Если бактерии устойчивы к пенициллину, то для обогащения можно применить другие антибиотики (новобиоцин, циклосерин, канамицин, налидиксовую кислоту и др.). С помощью подобных приемов можно обогащать популяцию бактерий не только ауксотрофными мутантами, но и мутантами других типов, например температуроустойчивыми (при этом антибиотик вызывает гибель клеток дикого типа, растущих при более высокой температуре), неспособными использовать определенный субстрат и др. Метод отпечатков - метод оперативного выявления биохимических мутаций у микроорганизмов; предложен Дж. Ледербергом в 1952, его суть состоит в "перепечатывании" бархатной "печаткой" колоний микроорганизма (в оригинале метода - E. coli), выросших на нормальной среде, в чашки Петри со средой, содержащей селективный агент, например, стрептомицин, - частота мутаций устойчивости к стрептомицину определяется по числу выросших "перепечатанных" колоний; реплик.