Кількісне визначення концентрації білків.

Кількісне визначення концентрації білків у білковому розчині може бути проведене різними методами:

1. Визначення азоту (метод Кєльдаля). Метод заснований на повній

руйнації молекул білку під дією сірчаної кислоти у присутності каталізатора. Метод вимагає великої кількості білку та значних затрат часу.

2. Амінокислотний аналіз. В цьому методі зразок білку піддається

повному гідролізу та визначенню амінокислотного складу.

3. Колориметричні методи. Досить прості у відтворенні, потребують

невеликої кількості білку (Біуретовий метод, метод Лоурі).

4. Метод Варбурга та Христіана базується на визначенні співвідношення

величини поглинання при 280 та 260 нм.

5. Флуориметричні методи.

Ми розглянемо методи визначення концентрації білку в розчині з біуретовим реактивом, з біуретовим реактивом в модифікації Ярош та за методом Лоурі.

Для визначення концентрації білку невідомого розчину спочатку необхідно побудувати калібрувальну криву. Для побудови такої кривої застосовуються стандартні білки. В якості такого стандарту можна використати альбумін сироватки крові бика. Перед приготуванням стандартного розчину альбумін висушують в вакуумі при 60⁰ С над Р₂О₄ до постійної маси. Готують розчин білку концентрації 500 мкг/мл. З цього розчину готують кілька розведень менших концентрацій (не менше 5 точок).

Для кожного розведення визначають ∆D. Відкладаючи на осі абсцис концентрацію білку, а на осі ординат значення ∆D, що відповідає цій концентрації. Будують калібрувальну криву.

Для визначення концентрації білку в невідому розчині готують певне розведення такого білку і, згідно методики, вимірюють ∆D для цього розчину. Потім на калібрувальній кривій відмічають це значення ∆D і визначають концентрацію білку в невідомому розчині з урахування величини розведення.

Самостійна робота студентів

1.Визначити концентрацію білку за допомогою біуретової реакції.

2.Визначити концентрацію білку з біуретовим реактивом за методом Ярош.

3.Визначити концентрацію білку за методом Лоурі.

4.Порівняти методи та написати висновок.

1. Визначення білку біуретовим методом

Біуретовий метод оснований на специфічній реакції пептидних звязків з іонами міді в лужному середовищі. Метод обмежений низькою чутливістю (концентрація білку не менше 50 мкг/мл).

Реактиви:

1. 3,9 г CuSO₄5H₂O та 6,7 г Na₂-ЕДТА розчиняють в 700 мл дистильованої води. Додають при постійному перемішуванні 200 мл 20%-ного NaOH до кінце-вого обєму 900 мл.

Матеріали та обладнання: штатив з пробірками, дозатори або піпетки, термостат на 20⁰ С, ФЕК з довжиною хвилі 545 нм.

Хід роботи

До 0,5 мл розчину білку додають 5,0 мл біуретового реактиву, інкубують 5 хв. при 20⁰ С та вимірюють поглинання при 545 нм (зелений світлофільтр), кювета 5 мм. Метод чутливий при концентрації білку 50-1000 мкг. Забарвлення стабільне протягом 1 години.

2.Визначення білку біуретовим методом по Ярош

Метод використовують в розчинах білку з концентрацією 0,04-1,6 мг/мл.

Реактиви:

1. В мірну колбу на 1 л наливають 400 мл 0,2 н розчину NaOH, додають 9 г калій-натрію виннокислого, перемішують до повного розчинення, додають 3 г CuSO₄5H₂O (порошок) та 5 г КJ, об'єм доводять до мітки 0,2 н розчином NaOH.

2. До 300 г сечовини (карбаміду) додають кусок тимолу величиною з горошину, приливають 700 мл дистильованої води. Суміш підігрівають, додають 3 г активованого вугілля, перемішують та фільтрують в мірну колбу на 1 л. Об'єм доводять до мітки дистильованою водою.

Матеріали та обладнання: штатив з пробірками, дозатори або піпетки, термостат при 60⁰ С, ФЕК з довжиною хвилі 540 нм.

Хід роботи

В пробірку приливають 2,4 мл розчину сечовини, 0,1 мл розчину білку та 2,5 мл біуретового реактиву. Суміш старанно перемішують і інкубують в термостаті при 40⁰ С протягом 10 хвилин, потім охолоджують до 20⁰ С. Через 30 хвилин після додавання біуретового реактиву розчин колориметрують на ФЕК при довжині хвилі 545 нм. Кількість білку знаходять за калібрувальною кривою, побудованою з використанням яєчного альбуміну.

Для побудови калібрувальної кривої спочатку готують розчини білку в воді з концентрацією 10, 20, 30, 40, 50, 60 мг білку в 10 мл. З одержаних розчинів відбирають в окремі пробірки по 0,1 мл, додають 2,4 мл розчину сечовини та 2,5 мл біуретового реактиву і вимірюють на ФЕК при 545 нм.