Нанесення точок на хроматографічний папір

Дозатором наносять на 1, 2, 3 точки відповідно 1, 2, 4 об'єми (або 1, 2 та 4 краплини) 0,01 М розчину амінокислоти, причому на кожну наступну точку наносять розчин після повного висушування попередньої точки нанесення. Якщо, наприклад, наносять об'єм на 1 точку 5 мкл, то на 2 точці буде 10 мкл, а на 3 – 20 мкл 0,01 М розчину амінокислоти або 0,05; 0,1; 0,2 мкмоль амінокислоти. На четверту точку наносять один об'єм амінокислоти невідомої концентрації.

Після нанесення всіх концентрацій амінокислот хроматографічний папір висушують на повітрі і занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 % -м розчином нінгідрину в ацетоні, просушують у витяжній шафі при кімнатній температурі і 15 хв прогрівають у термостаті при 60 °С для проявлення забарвлення.

Зони хроматограми з яскраво-ліловими плямами амінокислот вирізають. Збоку хроматографічного листка паперу на чистому місці вирізають контрольну зону, що дорівнює за площею дослідним. Вирізані зони паперу подрібнюють ножицями і поміщують в 5 окремих пробірок, які підписують згідно з номером точки та контрольною пробою. В кожну пробірку додають 5 мл 0,005%-го розчину сульфату міді в 75%-му етиловому спирті. Лілове забарвлення амінокислот переходить в оранжево-червоне внаслідок утворення Cu-похідного ДІДА і відбувається екстракція комплексної сполуки амінокислоти з паперу в розчин.

Для повної екстракції пробірки на 30 хвилин ставлять у темне місце при кімнатній температурі. Потім проби фотометрують проти контрольної на ФЕК з зеленим світлофільтром (довжина хвилі 540 нм). На основі знайденої оптичної густини та концентрації амінокислоти, що відповідає цій оптичній густині будують калібрувальний графік, де на осі абсцис позначають концентрацію амінокислоти у мікромолях ([А], мкмоль), а на осі ординат – оптичну густину (D). За знайденою оптичною густиною амінокислоти (точка 4) визначають невідому концентрацію амінокислоти та пишуть висновок.

ЛІТЕРАТУРА:

1. Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з курсу «Хімія біологічно активних речовин», С. 3-9.

2. Биохимия./ Н.Е. Кучеренко, Ю.Д. Бабенюк, А.Н. Васильев и др.- К.: Выща школа, 1988.- С.78-107, 295 – 340.

3. Основы аналитической химии./ Ю.А.Золотов, Е.Н.Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А.Золотова.- М.: Высшая школа, 2000.

4. Инструментальные методы химического анализа./ Г.Юинг.- М.: Мир,1989.

Лабораторна робота №4

(4 годин)

Тема: Визначення вмісту цитохромів Р₄₅₀ та b₅ в мікросомальній фракції печінки щурів за їх спектрами поглинання.

Мета роботи: навчитися визначати вміст ферментного білку в очищеному білковому препараті за спектрами поглинання.

Теоретичні відомості

Білки, як біологічно активні речовини, відіграють важливу роль в життєдіяльності клітин живої матерії.

Білки відносяться до органічних сполук, високомолекулярних природних полімерів, що складаються з одного або кількох поліпептидних ланцюгів, кожен з яких має біля 100 -амінокислотних залишків, ковалентно повязаних між собою. Всі білки незалежно від їх функції побудовані з 20 амінокислот, розташованих в різній, але специфічній для кожної білкової молекули послідовності. До складу білків, крім амінокислот, входять вуглець, водень, азот, кисень, сірка.

Однією з найбільш характерних властивостей ферментів є їх висока субстратна специфічність. Це означає, що фермент діє чітко тільки на одну речовину (абсолютна специфічність) або на невелику кількість близьких по будові речовин або речовин, що мають однакову функціональну групу з якою і взаємодіє фермент (широка субстратна специфічність). Ступінь специфічності може значно змінюватися у різних ферментів.

Вивчення специфічності ферментних білків дозволило встановити, що субстрат зєднується не зі всією молекулою фермента, а з її окремою частиною, що називається Активним центром фермента. Реакція, яку каталізує фермент протікає в такому центрі. Активний центр може знаходитися між субодиницями фермента або в заглибленні. Його поверхня комплементарна по формі субстрату який туди входить, там знаходять групи елементів, що утворюють водневі звязки з певними групами субстрату.

Ферментні білки, до складу яких входять атоми металів називаються металоферментами. Іони металів утворюють різного типу комплексні сполуки як з ферментним білком, так і з субстратом. До складу ферментних білків можуть входити катіони: Nа⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Co²⁺, Ni²⁺ та Al³⁺ - всього біля 15 металів.

Роль атомів металу в роботі ферментного білку:

1– метал є одним з компонентів каталітичного центру;

2 – атоми металу створюють або стабілізують просторову конформацію активного центру;

3 – атом металу активує ферментний білок;

4 – катіон металу повязує активний центр ферменту з молекулою субстрату.

Білок і метал виявляють взаємний вплив. Наявність іону металу в молекулі ферменту впливає на електронний та структурний стан білку і, таким чином, змінює його властивості. З іншого боку, білок створює для металу незвичну стереохімічну просторову будову, що в свою чергу впливає на властивості металу. Біологічна функція деяких металів полягає в запасанні відповідних іонів металів. Такі білки як кональбумін яєчного білку, трансферин плазми крові, зворотно звязують і переносять іони заліза, церулоплазмін переносить іони міді. Є білки, які контролюють концентрацію в організмі іонів кальцію, магнію, цинку на інших металів.

Атоми перехідних металів входять до складу ферментних білків, які беруть участь в ряді біологічних окисно-відновних процесів, задіяні в ферментних системах, що виконують функцію зберігання та транспорту кисню. Найбільш важливими є такі метали як залізо, мідь і кобальт, в меншій мірі, молібден. В реакціях окисно-відновні перетворення іонів металу лежать в основі певних каталітичних процесів, повязані з переносом електронів, окисленням або відновленням субстратів.

Серед металоферментів залізовміщуючі ферментні білки (гемопротеїн) є особливо важливими для біологічних процесів.

Представники цього класу відповідальні за транспорт та зберігання кисню (гемоглобін, міоглобін), перенесення електронів (цитохроми), каталіз окисно-відновних реакцій (оксидази та пероксидази), каталіз розкладення пероксиду водню (каталази).

Залізо входить до складу багатьох ферментних білків - цитохромів, пероксидаз, каталаз. Деякі ферменти переносять атоми заліза (ферритин), інші - контролюють його концентрацію (трансферин).

Ми знаємо, що білки діляться на прості (при гідролізі утворюють тільки амінокислоти) та складні (при гідролізі утворюють, крім амінокислот, органічні або неорганічні сполуки). Небілкова частина складного білку називається простетичною групою.

Угрупування простетичної групи де міститься атом заліза, називається гемом, а білки, що мають в своєму складі гем, називаються гемовими. Всі сполуки цього класу є похідними порфирину. Порфирини це високооргані-зовані органічні молекули, що мають порфиринове кільце, всередині цього кільця розміщується атом заліза (ІІ). Залізо (ІІ)-порфирини легко окислюються до залізо (ІІІ)-порфиринів.