Глава 4. Генетическая инженерия

ниже, чем при использовании преципитата кальция. Часто-. ту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 мин в 15%-м растворе глицерина в HEPES-буфере).

Электропорация — метод заключается в воздействии импульсов вьщокого напряжения электрического тока на клеточную мембрану, которое, скорее всего, вызывает временное образование большого количества пор, что обратимо увеличивает проницаемость мембран. Через образующиеся на короткое время поры чужеродная ДНК проникает в клетку. Это простой, эффективный и воспроизводимый метод. С его помощью были получены трансгенные растения кукурузы, риса и сахарного тростника.

Микроинъекции ДНК — метод позволяет с помощью тонких микроигл и микроманипулятора вводить в клетку или прямо в ядро векторную ДНК с включенным в нее трансгеном. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у дрозофилы и растений (ячмень, капуста). Метод, разработанный в начале 1970-х гг. А. Андерсоном и Г. Диакумакосом, дает небольшой выход трансформированных клеток. Его преимуществом является возможность вводить любую ДНК в любые клетки; кроме того, для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Упаковка в липосомы. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами. Липосомы, содержащие внутри рекомбинантную ДНК, способны непосредственно сливаться с мембраной клетки или поглощаться клетками. В клетке происходит разрушение оболочки липосом и высвобождение ДНК. Это один из методов, позволяющих защитить трансформированный генетический материал от разрушения нуклеазами, присутствующими вне клеток. Метод применяется для введения нуклеиновых кислот в культивируемые животные клетки и растительные протопласты.

Основные этапы создания трансгенных организмов

Процесс создания трансгенного организма достаточно сложен и часто требует индивидуального подхода. Однако в любом случае его можно подразделить на несколько общих этапов:

1. Получение (выделение) нужного гена (трансгена), на меченного для переноса. Ген может быть выделен из естественных источников (из подходящего генома) или из геномной библиотеки; синтезирован искусственно — химическим (по имеющейся последовательности нуклеотидов) или ферментативным (с использованием механизма обратной транскрипции: синтез к ДНК на матрице мРНК с помощью об ратной транскриптазы) путем; получен с помощью полиме-разной цепной реакции (ПЦР).

2. Создание специальных генетических конструкций — векторов (переносчиков), в составе которых содержатся гены (трансгены), которые будут внедряться в геном другого вида или экспрессироваться в клетках про- или эукариот. Для конструирования рекомбинантной ДНК (рекДНК) векторную ДНК (например, плазмиду) и чужеродную ДНК, содержащую интересующий ген (трансген), разрезают одной и той же рестриктазой; в результате образуются одинаковые концы. К генам, синтезированным химическим путем или полученным по матрице их мРНК, такие концы можно «пришить» искусственно. Затем производят смешивание фрагментов ДНК (вектора и трансгена) и «сшивание» их ДНК-лигазой. Концы чужеродной ДНК и плазмиды взаимодействуют друг с другом, образуя комплементарные пары оснований. Происходит гибридизация векторной и чужеродной ДЙК. Концы фрагментов замыкаются с помощью водородных связей и ковалентно «сшиваются» с помощью фермента ДНК-лигазы.

3. Генетическая трансформация, т. е. перенос и включение рек ДНК, содержащей трансген, в клетки реципиента (например, Е. coli). Плазмида, встроенная в бактерию, ведет себя, как вектор (переносчик) нового гена, который реплицируется в каждом новом поколении.

4. Молекулярная селекция — отбор трансформантов, т. е. клонов, несущих рек ДНК. В процессе генетической трансформации Е. coli могут образоваться три типа клеток: клетки, не содержащие пламиду, содержащие плазмиду без встройки (без рек ДНК), содержащие плазмиду с рек ДНК. Для отбора трансформантов среди ^трансформированных клеток используют различные маркерные гены, которые находятся в векторной молекуле наряду с трансгеном.

Так, плазмида pBR322 имеет два гена устойчивости к антибиотикам ампициллину (Amp^r) и тетрациклину (Tet^r). Один из генов служит для идентификации бактерий, несущих плазмиду (вектор) путем отбора клеток, устойчивых к антибиотику, а другой — для отличия гибридной плазмиды (рекДНК) от исходного вектора. В гене Tet^r имеется уникальный сайт, разрезаемый рестриктазой BamHl. Если разрезать вектор в гене Tet^r рестриктазой ВатШ. и встроить в него фрагмент чужеродной ДНК, полученный с помощью той же рестриктазы, то ген Tet^r инактивируется, и у бактерий, несущих плазмиду, исчезает устойчивость к тетрациклину, но сохраняется устойчивость к ампициллину. Отбор на среде с ампициллином покажет, содержит Е. coli плазмиду или нет. Содержащие плазмиду бактерии будут расти на среде с ампициллином. Для отбора клеток, несущих чужеродную ДНК (интересующий нас ген), бактерии выращивают на среде с тетрациклином. Трансформированные клетки устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (такие колонии отсутствуют на среде с тетрациклином), так как ген устойчивости к тетрациклину разрушен в результате вставки фрагмента чужеродной ДНК. Помимо плазмиды pBR322, используется множество других векторов для клонирования (pUC19, pET, pQE), причем для некоторых из них существуют весьма остроумные системы отбора рекомбинантных клонов (например, окрашивание колонии клеток, содержащих немодифицированную плазмиду pUC19).

5. Выращивание измененных клеток в целые трансгенные организмы. Синтез определенного белка — продукта введенного гена.

Первый, второй и третий из перечисленных этапов представляют собой последовательное создание рекомбинантной ДНК, четвертый и пятый — трансгеноз и выявление трансгенного организма.

После введения в реципиентную клетку фрагмента чужеродной ДНК происходит ее клонирование с целью получения большого числа копий или начинается синтез продукта, закодированного во введенном гене. Чаще всего эти процессы осуществляются в бактериальных клетках. Поэтому клонирование прокариотической ДНК в клетках прокариот не вызывает осложнений. Клонирование эукариоти-ческой ДНК требует дополнительных методических приемов, так как существуют различия в строении генома у прокариот и эукариот. У прокариот кодирующие домены структурных генов непрерывны, а у эукариот кодирующие области (экзоны) разделены некодирующими (интронами). Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-транскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических мРНК в бактериальных клетках невозможна. Для удаления интронов из эукариотической ДНК был предложен метод синтеза ДНК-копии (кДНК) на мРНК.