2 Практическая часть

2.1 Методика определения летучих жирных кислот методом газо-жидкостной хроматографии

Для определения летучих жирных кислот в различных биотопах человека и животных применяют разделение подкисленного инфильтрата пробы на хроматографе с капиллярными колонками и пламенно-ионнизационным детектором. Для расчета концентрации используется метод внутреннего стандарта, который состоит в добавлении к определенной массе исследуемого материала вещества с известной массой и известной площадью пика. Расчет концентраций по площадям пиков делает компьютерная программа, использующая специальный интерфейс для ввода хроматограмм с выхода усилителя малых токов хроматографа, специальный формат файлов для хранения хроматограмм и интерфейс для расчета концентраций определяемых ЛЖК по площади пиков. Компьютерная обработка результатов позволяет сделать расчет концентраций более точно и быстро, чем вручную. Таким образом, определение концентраций ЛЖК в слюне проходит в несколько этапов: пробоподготовка, хроматографирование, обработка результатов.

2.2 Пробоподготовка

Для определения ЛЖК используется инфильтрат пробы. Получение инфильтрата проходит по следующей схеме:

1. В одноразовой пластиковой пробирке взвешивают 2 - 3 грамма содержимого пробы на аналитических весах с точностью до 3-го знака.

2. К пробе приливают 1 мл. 0,02N соляной кислоты, 1 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного вещества. Пробирку закрывают притертой пробкой и гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания. Если необходимо определить концентрацию ЛЖК в крови, в смесь добавляют так же 0,5 мл. 0,01N HClO₄.

3. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 10 минут при 6000 об./мин.

4. Полученный инфильтрат должен быть прозрачным, иметь кислую реакцию.

3. Порядок работы на хроматографе

1. Включаем в сеть все блоки хроматографа и компьютер, на котором загружаем обслуживающую интерфейсную программу.

2. Открываем запорный вентиль на баллоне газа носителя 1 и редуктор 4 газа носителя до отметки на выходном манометре редуктора 5 атм. Устанавливаем на манометре 9 газового блока 10 ручкой регулятора 8 давление 1,8 атм. Включаем нагрев на блоке автоматической регулировки температуры термостата 14. Прогреваем термостат до температуры 140⁰С, а испаритель 18 до температуры 240⁰С.

3. Открываем запорные вентили на баллонах водорода 2 и сжатого воздуха 3, редукторы 4 этих баллонов до отметки на выходных манометрах редукторов 5 атм. Устанавливаем на манометрах 9 газового блока 10 ручками регуляторов 8 давление 0,05 атм. - для водорода и 0,35 — для сжатого воздуха. Поджигаем водородную горелку 19. При достижении устойчивого пламени горелки, которое можно контролировать с помощью интерфейсной программы, компенсаторной ручкой измерителя малых токов 22 устанавливается нулевое значение виртуального компьютерного самописца.

4. Одноразовым стеклянным капилляром отбирается микроколичество надосадочной жидкости пробы. Капилляр запаивается с одной стороны и прикрепляется к специальному устройству. При помощи специального устройства ввода пробы 17 капилляр помещают в испаритель 18 и запускают программу считывания хроматограммы. После считывания хроматограммы ее сохраняют на жестком диске компьютера в файле специального формата. Хроматограмма представляет собой совокупность значений дисбаланса напряжений компенсационного моста измерителя малых токов 22 выраженных в мВ, снятых с определенным интервалом времени.

5. После считывания всех хроматограмм колонка хроматографа конденсируется при температуре 220⁰С в течение 40 минут. После конденсирования колонки хроматограф отключают в следующем порядке: До начала конденсации закрывают редуктора (4) и вентили баллонов с водородом (2) и сжатым воздухом (3). По окончании конденсации температуру термостата медленно опускают до комнатной, отключают нагрев, закрывают редуктор (4) и вентиль баллона с газом носителем 1.