33. Гемоглобин, его функции и соединения. Методы определения.

Основные функции эритроцитов связаны с наличием в их составе особого белка хромопротеида, получившего наименование гемоглобин. Молекулярная масса гемоглобина человека равна 68800 Да. Состоит гемоглобин из белковой (глобин) и железосодержащей (гемм) частей. На одну молекулу глобина приходится 4 молекулы гемма.

В крови здорового человека содержание гемоглобина колеблется несколько ниже (до 150 г/литр), чем у мужчин (до 160 г/литр). У беременных женщин содержание гемоглобина может падать до 110 г/литр, и это не является патологией.

У жителей, проживающих на высоте 2000 метров, количество гемоглобина в среднем на 10 г/литр, а на уровне 3000 м - на 20 г/литр больше, чем на равнине. При этом одновременно наблюдается повышение числа эритроцитов.

Основное назначение гемоглобина - транспорт кислорода и углекислого газа. Кроме того, гемоглобин обладает буферными свойствами, а также способностью связывать некоторые токсические вещества, благодаря чему поддерживается постоянство внутренней среды - гомеостаз.

Гемоглобин человека и разных животных имеет различное строение. Это касается белковой части - глобина, ибо гемм у всех представителей животного мира имеет одну и ту же структуру. Он состоит из молекулы порфирина, в центре которой расположен атом железа со степенью окисления +2, способный присоединять кислород. Белковая часть гемоглобина человека неоднородна по своей структуре, благодаря чему разделяется на ряд фракций. Большая часть гемоглобина взрослого человека (до 95-98 %) состоит из фракции А (от слова adultus - взрослый). От 2 до 3 % всего гемоглобина приходится на фракцию А2. Наконец, в эритроцитах взрослого человека находится так называемый фетальный гемоглобин (от лат. foetus - плод), или гемоглобин F,содержание его в норме подвержено значительным колебаниям, хотя редко превышает 1-2 %. Гемоглобины А и А2 обнаруживаются практически во всех эритроцитах, тогда как гемоглобин F присутствует в них не всегда.

Гемоглобин F содержится преимущественно у плода. К моменту рождения ребенка на его долю приходится до 70-90 %. Гемоглобин F имеет большее сродство к кислороду, чем гемоглобин А, что позволяет тканям плода не испытывать гипоксии, несмотря на относительно низкое напряжение кислорода в его крови. Эта приспособительная реакция объясняется тем, что гемоглобин более трудно вступает в связь с 2,3-дифосфоглицериновой кислотой (2,3-ДФГК), которая уменьшает способность гемоглобина образовывать оксигемоглобин, но приводит к более легкой его отдаче тканям. 2,3-ДФГК образуется в процессе метаболизма по побочному пути гликолиза.

Кроме так называемых «нормальных» гемоглобинов, существуют еще аномальные, встречающиеся при различных заболеваниях системы крови. В настоящее время насчитывается более 300 аномальных гемоглобинов. Все они отличаются друг от друга строением глобина.

Первичными структурными элементами молекулы гемоглобина являются полипептидные цепи, носящие наименование протомеров и состоящие из аминокислот. Свойства гемоглобина, наличие нормальных и патологических гемоглобинов зависит от того порядка, в котором расположены аминокислоты, а также от того, находятся цепи в виде спиралей или в простом виде, т.е. от вторичной, третичной и четвертичной его структуры (рис.6).

Все эти фракции (А, А2, F) гемоглобина состоят из одинакового количества аминокислот (574),располагающихся в виде четырех полипептидных цепей. В зависимости от последовательности аминокислот эти цепи обозначаются греческими буквами б, в, г и д. Гемоглобин А состоит из двух б-цепей и двух в-цепей, гемоглобин А2 - из двух б-цепей и двух д-цепей, гемоглобин F - из двух б-цепей и двух г-цепей. В б-цепь гемоглобина входит 141 аминокислота, остальные содержат по 146 аминокислот каждая.

Порядок расположения аминокислот в цепях гемоглобина обозначается как первичная структура. 75 % полипептидных цепей гемоглобина закручены вокруг своей продольной оси и составляют б-спираль, а 25 % - неспиральные участки. Это так называемая вторичная структура гемоглобина. Третичная структура гемоглобина связана с пространственным расположением спирализованной полипептидной цепи в белковой молекуле. Наконец, четвертичная структура обусловлена связью между полипептидными цепями. Так, в гемоглобина А б-цепь связана с в-цепью,составляя субъединицу. Две такие субъединицы и образуют молекулу гемоглобина (рис.6).

Внутри гемоглобина молекулы находятся в тесном взаимодействии. Гемоглобин обладает способностью образовывать соединения с О2, СО2 и СОю Гемоглобин, присоединивший О2, носит наименование оксигемоглобина (ННbО2); гемоглобин, отдавший О2, называется восстановленным, или редуцированным гемоглобином (ННb). В артериальной крови преобладает содержание оксигемоглобина, от чего ее цвет приобретает алую окраску. Венозной крови до 35 % всего гемоглобина приходится на ННb. Кроме того, часть гемоглобина через аминную группу связывается с СО2, образуя карбогемоглобин (ННbСО2), благодаря чему переносится от 10до 20 % всего транспортируемого кровью СО2.

Гемоглобин способен образовывать довольно прочную связь с СО. Это соединение называется карбоксигемоглобин (ННbСО). Сродство гемоглобина к СО значительно выше, чем к О2, поэтому гемоглобин, присоединивший СО, не способен связаться с О2. Однако при вдыхании чистого О2 резко возрастает скорость распада карбоксигемоглобина, чем на практике пользуются при отравлении СО.

Сильные окислители (ферроцианид, бертолетова соль, перекись водорода и др.)изменяют заряд от Fe2+ до Fe3+, в результате чего возникает окисленный гемоглобин - прочное соединение гемоглобина с О2, носящее наименование метмоглобин. При этом нарушается транспорт О2, что может привести к тяжелейшим последствиям и даже смерти.

Цветовой показатель и абсолютное содержание гемоглобина в одном эритроците

О содержании в эритроцитах гемоглобина судят по так называемому цветовому показателю, или фарб-индексу (Fi, от farb - цвет, index - показатель) - относительной величине, характеризующей насыщение в среднем одного эритроцита гемоглобином. Fi -это процентное соотношение гемоглобина и эритроцитов, при этом за 100 % (или единиц) гемоглобина условно принимается величина, равная 166,7 г/литр, а за 100 % эритроцитов 5г 1012/литр.

Если у человека содержание гемоглобина и эритроцитов равно 100 %,то цветовой показатель будет равен 1.В норме Fi колеблется в пределах от 0,75 до 1,0 и очень редко может достигать 1,1. В этом случае эритроциты носят название нормохромные. Если Fi менее 0,7, то такие эритроциты недонасыщены гемоглобином и называются гипохромными. При Fi, превышающем 1,1, эритроциты именуются гиперхромными. В этом случае объем эритроцита значительно увеличивается. В результате создается ложное впечатление, будто эритроциты перенасыщены гемоглобином. Гипо- и гиперхромия встречаются лишь при анемиях. Так, в случае недостатка железа в организме образование гемоглобина нарушается и возникает гипохромная анемия. При пернициозной (злокачественной) анемии нарушается эритропоэз в костном мозге, и в крови появляются гигантские деформированные эритроциты с высоким содержанием гемоглобина. В этом случае развивается гиперхромная анемия. При кровопотере одновременно снижается содержание эритроцитов и гемоглобина, и потому анемия будет нормохромная. Однако в дальнейшем, благодаря выбросу в кровоток эритроцитов, недонасыщенных гемоглобином, анемия в течение некоторого времени носит гипохромный характер. Определение цветового показателя чрезвычайно важно для клинической практики, так как позволяет провести дифференциальный диагноз при анемиях различной этиологии.

Следует отметить, что у жителей горных районов, несмотря на повышение числа эритроцитов и уровня гемоглобина, цветовой показатель сохраняется в пределах нормы.

В последние годы во многих клиниках мира определяется не цветовой показатель, а среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (СГЭ или МНС - от слов mean corpuscular hemoglobin). Величину МНС находят путем деления содержания гемоглобина в определенном объеме крови на число эритроцитов в том же объеме. Приведем пример такого расчета. Представим себе, что у здорового мужчины в 1 литре крови содержится 160 г гемоглобина и 5гг1012 эритроцитов. СГЭ равно отношению этих величин.

В среднем абсолютное содержание гемоглобина водном эритроците (МНС) у мужчин и женщин практически одинаково и колеблется в пределах 28-33 пг.

34. Механизмы гемостаза (сосудисто-тромбоцитарный, гемокоагуляционный).Регуляция свертывания крови. Средства, применяемые при нарушении свертывания крови (антитромботические и гемостатические)

• Современные представления о системе регуляции агрегантного состояния крови позволяют выделить основные механизмы её деятельности:

o Механизмы гемостаза (их несколько) обеспечивают остановку кровотечения.

o Механизмы антисвёртывания поддерживают жидкое состояние крови.

o Механизмы фибринолиза обеспечивают растворение тромба (кровяного сгустка) и восстановление просвета сосуда (реканализацию).

В обычном состоянии слегка преобладают противосвёртывающие механизмы, однако при необходимости предотвратить кровопотерю физиологический баланс быстро смещается в сторону прокоагулянтов. Если этого не происходит, развивается повышенная кровоточивость (геморрагические диатезы), преобладание прокоагулянтной активности крови чревато развитием тромбозов и эмболий. Выдающийся немецкий патолог Рудольф Вирхов выделил три группы причин, ведущих к развитию тромбоза (классическая триада Вирхова):

o Повреждение сосудистой стенки.

o Изменение состава крови.

o Замедление кровотока (стаз).

В структуре артериальных тромбозов преобладает первая причина (атеросклероз); замедление кровотока и преобладание прокоагулянтных факторов – основные причины венозных тромбозов.

Различают два механизма гемостаза:

o Сосудисто-тромбоцитарный (микроциркуляторный, первичный).

o Коагуляционный (вторичный, свёртывание крови).

Сосудисто-тромбоцитарный механизм гемостаза обеспечивает остановку кровотечения в мельчайших сосудах (в сосудах микроциркуляторного русла), где имеются низкое кровяное давление и малый просвет сосудов (до 100 мкм). В них остановка кровотечения может произойти за счёт:

o Сокращения стенок сосудов.

o Образования тромбоцитарной пробки.

o Сочетания того и другого.

Коагуляционный гемостаз обеспечивает остановку кровотечения в более крупных сосудах (артериях и венах). В них остановка кровотечения осуществляется за счёт свёртывания крови (гемокоагуляции).

Полноценная гемостатическая функция возможна только при условии тесного взаимодействия сосудисто-тромбоцитарного и гемокоагуляционного механизмов гемостаза. Тромбоцитарные факторы принимают активное участие в коагуляционном гемостазе, обеспечивают конечный этап формирования полноценной гемостатической пробки – ретракцию кровяного сгустка. В то же время плазменные факторы непосредственно влияют на агрегацию тромбоцитов. При ранениях как мелких, так и крупных сосудов происходит образование тромбоцитарной пробки с последующим свёртыванием крови, организацией фибринового сгустка, а затем – восстановление просвета сосудов (реканализация путём фибринолиза).

Реакция на повреждение сосуда зависит от разнообразных процессов взаимодействия между сосудистой стенкой, циркулирующими тромбоцитами, факторами свёртывания крови, их ингибиторами и фибринолитической системой. Гемостатический процесс модифицируется посредством положительной и отрицательной обратной связи, которая поддерживает стимуляцию констрикции сосудистой стенки и образование комплексов тромбоциты-фибрин, а также растворение фибрина и релаксацию сосудов, что позволяет вернуться к нормальному состоянию.

Для того чтобы кровоток в обычном состоянии не нарушался, а при необходимости наступало эффективное свёртывание крови, необходимо поддержание равновесия между факторами плазмы, тромбоцитов и тканей, способствующими свёртыванию и тормозящими его. Если это равновесие нарушается, возникает либо кровотечение (геморрагические диатезы), либо повышенное тромбообразование (тромбозы).

• Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

У здорового человека кровотечение из мелких сосудов при их ранении останавливается за 1-3 минуты (так называемое время кровотечения). Этот первичный гемостаз почти целиком обусловлен сужением сосудов и их механической закупоркой агрегатами тромбоцитов – «белым тромбом».

Тромбоциты (кровяные пластинки, нормальное содержание в крови 170-400х10 9 /л) представляют собой плоские безъядерные клетки неправильной округлой формы диаметром 1-4 мкм. Кровяные пластинки образуются в красном костном мозге путём отщепления участков цитоплазмы от гигантских клеток – мегакариоцитов; из каждой такой клетки может возникнуть до 1000 тромбоцитов. Тромбоциты циркулируют в крови в течение 5-11 дней и затем разрушаются в селезёнке.

В крови тромбоциты пребывают в неактивированном состоянии. Их активация наступает в результате контакта с активирующей поверхностью и действия некоторых факторов свёртывания. Активированные тромбоциты выделяют ряд веществ, необходимых для гемостаза.

o Агрегация тромбоцитов

Коллаген и тромбин также стимулируют фосфолипазы тромбоцитарной мембраны, освобождая арахидоновую кислоту из её фосфолипидного слоя. Арахидоновая кислота посредством тромбоцитарной циклооксигеназы (ЦОГ-1) превращается в простагландины H 2 и G 2 (PGH 2 и PGG 2 ), из которых образуются тромбоксаны A 2 (TxA 2 ) и B 2 (TxB 2 ) (рис. 1, рис. 8). Указанные простагландины, TxA 2 вместе с выделяемыми из гранул тромбоцитов аденозиндифосфатом (АДФ) и фактором активации тромбоцитов (ФАТ) (рис. 1 п. 3) инициируют необратимую агрегацию циркулирующих тромбоцитов (из которых, в свою очередь, также выделяются биологически активные вещества) и закрытие участка поражения тромбоцитарной «пробкой» (рис. 1. п. 5; рис. 7). Тромбоксан А 2 , кроме того, усиливает суживание сосудов. При распаде тромбоцитов в среду выходят фосфолипопротеины их мембраны – тромбоцитарный фактор 3, участвующий в коагуляционном гемостазе (служит матрицей, на поверхности которой происходит формирование теназного и протромбиназного комплексов).

Для необратимой агрегации тромбоцитов необходим также фибриноген. Это вещество не только служит предшественником фибрина, образующего сеть, в которой запутываются тромбоциты в ходе образования сгустка (коагуляционный гемостаз), но также вступает в специфическую реакцию с рецепторами активированных кровяных пластинок (гликопротеинами IIb и IIIa). Эти гликопротеины также обеспечивают взаимодействие тромбоцитов с субэндотелиально расположенным фибронектином, способствуя адгезии. У больных с недостатком гликопротеинов IIb/IIIa наблюдается повышенная кровоточивость, хотя количество тромбоцитов у них не снижено (тромбастения Гланцмана-Негели). Полагают, что подобно фибриногену действуют гликопротеины фибронектин и тромбоспондин, содержащиеся в альфа-гранулах кровяных пластинок.

На периферии тромбоцитарной пробки происходит дезагрегация тромбоцитов из-за выделения антиагрегантов, в частности простациклина (PGI2), окиси азота (NO), аденозиндифосфотазы (АДФазы) и других ферментов, синтезируемых интактными соседними эндотелиальными клетками.

Такой первичной тромбоцитарной пробки достаточно для того, чтобы начался гемостаз, и незамедлительно остановилось развившееся кровотечение, но сама по себе она не в состоянии длительное время поддерживать целостность сосуда.

Точная последовательность событий, происходящих при активации тромбоцитов, пока не выяснена. Это связано, в частности, с тем, что на некоторых этапах существует положительная обратная связь – активированные тромбоциты выделяют вещества, которые в свою очередь вызывают активацию тромбоцитов. В качестве примеров можно привести действие АДФ и петлю обратной связи, включающую активацию тромбоцитарного фактора 3 и эффект тромбина. Эти взаимодействия приводят к лавинообразному усилению процесса, т.е. тромбоциты всё быстрее вовлекаются в реакцию.

o Клиническое значение нарушений в сосудисто-тромбоцитарном звене гемостаза

При уменьшении количества тромбоцитов (тромбоцитопении) или нарушении их структуры (тромбоцитопатии) возможно развитие геморрагического синдрома с петехиально-пятнистым типом кровоточивости. Тромбоцитоз (увеличение содержания тромбоцитов) предрасполагает к гиперкоагуляции и тромбозам. К методам оценки состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза относят определение резистентности (ломкости) капилляров (манжеточная проба Румпель-Лееде-Кончаловского, симптомы жгута и щипка), время кровотечения, подсчёт числа тромбоцитов, оценку ретракции сгустка крови, определение ретенции (адгезивности) тромбоцитов, исследование агрегации тромбоцитов.

К агрегации тромбоцитов даже в отсутствии внешних повреждений могут приводить дефекты эндотелиальной оболочки сосудов. С целью предупреждения тромбозов назначают препараты, подавляющие агрегацию тромбоцитов - антиагреганты. Ацетилсалициловая кислота (аспирин) селективно и необратимо ацетилирует фермент циклооксигеназу (ЦОГ), катализирующую первый этап биосинтеза простаноидов из арахидоновой кислоты. В невысоких дозах препарат влияет преимущественно на изоформу ЦОГ-1. В результате в циркулирующих в крови тромбоцитах прекращается образование тромбоксана A 2 , обладающего проагрегантным и сосудосуживающим действием. Метаболиты производных тиенопиридина (клопидогрел, тиклопидин) необратимо модифицируют рецепторы 2PY 12 на мембране тромбоцитов, в результате блокируется связь АДФ с его рецептором на мембране тромбоцита, что приводит к угнетению агрегации тромбоцитов. Дипиридамол угнетает фермент фосфодиэстеразу в тромбоцитах, что приводит к накоплению в тромбоцитах цАМФ, обладающего антиагрегантным действием. Блокаторы гликопротеинов IIb/IIIa тромбоцитов (абциксимаб, тирофибан и эптифибатид) воздействуют на конечную стадию агрегации, блокируя участок взаимодействия гликопротеинов IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов с фибриногеном и другими адгезивными молекулами.

В настоящее время проходят клинические испытания новых антиагрегантов (тикагрелор, прасугрел).

В качестве местного кровоостанавливающего средства используется губка гемостатическая коллагеновая, усиливающая адгезию и активацию тромбоцитов, а также запускающая коагуляционный гемостаз по внутреннему пути.

• Коагуляционный гемостаз

o Общие положения

После того как образуется тромбоцитарный сгусток, степень сужения поверхностных сосудов уменьшается, что могло бы привести к вымыванию сгустка и возобновлению кровотечения. Однако к этому времени уже набирают достаточную силу процессы коагуляции фибрина в ходе вторичного гемостаза, обеспечивающего плотную закупорку повреждённых сосудов тромбом («красным тромбом»), содержащим не только тромбоциты, но и другие клетки крови, в частности эритроциты.

Постоянная гемостатическая пробка формируется при образовании тромбина посредством активации свёртывания крови. Тромбин играет важную роль в возникновении, росте и локализации гемостатической пробки. Он вызывает необратимую агрегацию тромбоцитов (неразрывная связь коагуляционного и сосудисто-тромбоцитарного звеньев гемостаза) (рис. 8) и отложение фибрина на тромбоцитарных агрегатах, образующихся в месте сосудистой травмы. Фибрино-тромбоцитарная сеточка является структурным барьером, предотвращающим дальнейшее вытекание крови из сосуда, и инициирует процесс репарации ткани.

Свёртывающая система крови – это фактически несколько взаимосвязанных реакции, протекающих при участии протеолитических ферментов. На каждой стадии данного биологического процесса профермент (неактивная форма фермента, предшественник, зимоген) превращается в соответствующую сериновую протеазу. Сериновые протеазы гидролизуют пептидные связи в активном центре, основу которого составляет аминокислота серин. Тринадцать таких белков (факторы свёртывания крови) составляют систему свёртывания (таблица 1; их принято обозначать римскими цифрами (например, ФVII – фактор VII), активированную форму обозначают прибавлением индекса «а» (ФVIIа – активированный фактор VIII). Из них семь активируются до сериновых протеаз (факторы XII, XI, IX, X, II, VII и прекалликреин), три являются кофакторами этих реакций (факторы V, VIII и высокомолекулярный кининоген ВМК), один – кофактор/рецептор (тканевой фактор, фактор III), ещё один – трасглутаминаза (фактор XIII) и, наконец, фибриноген (фактор I) является субстратом для образования фибрина, конечного продукта реакций свёртывания крови (таблица 1).

Для пострибосомального карбоксилирования терминальных остатков глутаминовой кислоты факторов свёртывания II, VII, IX, X (витамин К-зависимые факторы), а также двух ингибиторов свёртывания (протеинов C (си) и S) необходим витамин К. В отсутствии витамина К (или на фоне приёма непрямых антикоагулянтов, например, варфарина) печень содержит лишь биологически неактивные белковые предшественники перечисленных факторов свёртывания. Витамин К – необходимый кофактор микросомальной ферментной системы, которая активирует эти предшественники, превращая их множественные N-концевые остатки глутаминовой кислоты в остатки ? -карбоксиглутаминовой кислоты. Появление последних в молекуле белка придёт ему способность связывать ионы кальция и взаимодействовать с мембранными фосфолипидами, что необходимо для активации указанных факторов. Активная форма витамина К – восстановленный гидрохинон, который в присутствии O 2 , CO 2 и микросомальной карбоксилазы превращается в 2,3-эпоксид с одновременным ?-карбоксилированием белков. Для продолжения реакций ? –карбоксилирования и синтеза биологически-активных белков витамин К опять должен восстановиться в гидрохинон. Под действием витамин-К-эпоксидредуктазы (которую ингибируют терапевтические дозы варфарина) из 2,3-эпоксида вновь образуется гидрохиноновая форма витамина К.

Механизмы инициации свёртывания крови подразделяют на внешние и внутренние. Такое деление искусственно, поскольку оно не имеет места in vivo, но данный подход облегчает интерпретацию лабораторных тестов in vitro.

Большинство факторов свёртывания циркулируют в крови в неактивной форме. Появление стимулятора коагуляции (триггера) приводит к запуску каскада реакций, завершающихся образованием фибрина (рис. 10). Триггер может быть эндогенным (внутри сосуда) или экзогенным (поступающим из тканей). Внутренний путь активации свёртывания крови определяется как коагуляция, инициируемая компонентами, полностью находящимися в пределах сосудистой системы. Когда процесс свёртывания начинается под действием фосфолипопротеинов, выделяемых из клеток повреждённых сосудов или соединительной ткани, говорят о внешней системе свёртывания крови. В результате запуска реакций системы гемостаза независимо от источника активации образуется фактор Xa, обеспечивающий превращение протромбина в тромбин, а последний катализирует образование фибрина из фибриногена. Таким образом, и внешний и внутренний пути замыкаются на единый – общий путь свёртывания крови.

? Внешний путь активации свёртывания крови

Основным путём активации свёртывания крови in vivo считается внешний путь. Компоненты этого пути следующие: тканевой фактор (ТФ, фактор III, тканевая тромбокиназа, тканевой тромбопластин), его ингибитор (ингибитор пути тканевого фактора, ИПТФ) и плазменный фактор VII. Тканевой фактор представляет собой внутренний мембранный гликопротеин (масса 47 кДа), имеющийся во многих клетках; он не поступает в кровь до тех пор, пока не образуются протеазы или не произойдёт повреждение клеток in vivo. Тканевой фактор функционирует в качестве кофактора/рецептора, который в присутствии ионов кальция активирует фактор VII. Активация фактор VII приводит к открытию (обнажению) его активного серинового центра. Активация фактора VII может также происходить за счёт незначительного протеолитического действия других сериновых протеаз (тромбина, ФXIIa, ФIXa, и ФXa), а также за счёт самоактивации, однако самоактивация in vivo идёт незначительно. Комплекс ТФ/ФVIIa/Ca 2+ действует на два субстрата: фактор X (запуск общего пути) и ФIX (фактор внутреннего пути).

? Внутренний путь активации свёртывания крови

Компонентами внутреннего пути являются факторы XII, XI, IX, XIII, кофакторы – высокомолекулярный кининоген (ВМК) и прекалликреин (ПК), а также их ингибиторы.

Внутренний путь (рис. 10 п. 2) запускается при повреждении эндотелия, когда обнажается отрицательно заряженная поверхность (например, коллаген) в пределах сосудистой стенки. Контактируя с такой поверхностью, активируется ФXII (образуется ФXIIa). Фактор XIIa активирует ФXI и превращает прекалликреин (ПК) в калликреин, который активирует фактор XII (петля положительной обратной связи). Механизм взаимной активации ФXII и ПК отличается большей быстротой по сравнению с механизмом самоактивации ФXII, что обеспечивает многократное усиление системы активации. Фактор XI и ПК связываются с активирующей поверхностью посредством высокомолекулярного кининогена (ВМК). Без ВМК активации обоих проферментов не происходит. Связанный ВМК может расщепляться калликреином (К) или связанным с поверхностью ФXIIa и инициировать взаимную активацию систем ПК-ФXII.

Фактор XIa активирует фактор IX. Фактор IX может также активироваться под действием комплекса ФVIIa/ФIII (перекрёст с каскадом внешнего пути), причём считается, что in vivo это доминирующий механизм. Активированный ФIXa требует наличия кальция и кофактора (ФVIII), для прикрепления к тромбоцитарному фосфолипиду (тромбоцитарному фактору 3 – см. раздел сосудисто-тромбоцитарный гемостаз) и превращения фактора X в фактор Xa (переход с внутреннего на общий путь). Фактор VIII действует в качестве мощного ускорителя завершающей ферментативной реакции.

Фактор VIII, который также называют антигемофильным фактором, кодируется большим геном, расположенным на конце X-хромосомы. Он активируется под действием тромбина (основной активатор), а также факторов IXa и Xa. ФVIII циркулирует в крови, будучи связанным с фактором фон Виллебранда (ФВ) – большим гликопротеином, продуцируемым эндотелиальными клетками и мегакариоцитами (см. также раздел сосудисто-тромбоцитарный гемостаз). ФВ служит внутрисосудистым белком-носителем для ФVIII. Связывание ФВ с ФVIII стабилизирует молекулу ФVIII, увеличивает её период полусуществования внутри сосуда и способствует её транспорту к месту повреждения. Однако чтобы активированный фактор VIII мог проявить свою кофакторную активность, он должен отсоединиться от ФВ. Воздействие тромбина на комплекс ФVIII/ФВ приводит к отделению ФVIII от несущего протеина и расщеплению на тяжёлую и лёгкую цепи ФVIII, которые важны для коагулянтной активность ФVIII.

? Общий путь свёртывания крови (образование тромбина и фибрина)

Внешний и внутренний пути свёртывания крови замыкаются на активации ФX, с образования ФXa начинается общий путь. Фактор Xa активирует ФV. Комплекс факторов Xa, Va, IV (Ca 2+ ) на фосфолипидной матрице (главным образом это тромбоцитарный фактор 3) - является протромбиназой, которая активирует протромбин (превращение ФII в ФIIa).

Тромбин (ФIIa) представляет собой пептидазу, особенно эффективно расщепляющую аргиниловые связи. Под действием тромбина наступает частичный протеолиз молекулы фибриногена. Однако функции тромбина не ограничиваются влиянием на фибрин и фибриноген. Он стимулирует агрегацию тромбоцитов, активирует факторы V, VII, XI и XIII (положительная обратная связь), а также разрушает факторы V, VIII и XI (петля отрицательная обратной связи), активирует фибринолитическую систему, стимулирует эндотелиальные клетки и лейкоциты. Он также вызывает миграцию лейкоцитов и регулирует тонус сосудов. Наконец, стимулируя рост клеток, способствует репарации тканей.

Тромбин вызывает гидролиз фибриногена до фибрина. Фибриноген (фактор I) представляет собой сложный гликопротеин, состоящий из трёх пар неидентичных полипептидных цепей. Тромбин прежде всего расщепляет аргинин-глициновые связи фибриногена с образованием двух пептидов (фибринопептид А и фибринопептид B) и мономеров фибрина. Эти мономеры образуют полимер, соединяясь бок в бок (фибрин I) и удерживаясь рядом водородными связями (растворимые фибрин-мономерные комплексы – РФМК). Последующий гидролиз этих комплексов при действии тромбина приводит к выделению фибринопептида B. Кроме того, тромбин активирует ФXIII, который в присутствии ионов кальция связывает боковые цепи полимеров (лизин с глутаминовыми остатками) изопептидными ковалентными связями. Между мономерами возникают многочисленные перекрёстные связи, создающие сеть взаимодействующих фибриновых волокон (фибрин II), весьма прочных и способных удерживать тромбоцитарную массу на месте травмы.

Однако на этой стадии трёхмерная сеть волокон фибрина, которая удерживает в больших количествах клетки крови и кровяные пластинки, всё ещё относительно рыхлая. Свою окончательную форму она принимает после ретракции: через несколько часов волокна фибрина сжимаются и из него как бы выдавливается жидкость – сыворотка, т.е. лишённая фибриногена плазма. На месте сгустка остаётся плотный красный тромб, состоящий из сети волокон фибрина с захваченными ею клетками крови. В этом процессе участвуют тромбоциты. В них содержится тромбостенин – белок, сходный с актомиозином, способный сокращаться за счёт энергии АТФ. Благодаря ретракции сгусток становится более плотным и стягивает края раны, что облегчает её закрытие клетками соединительной ткани.

Регуляция системы свертывания крови

Активация свёртывания крови in vivo модулируется рядом регуляторных механизмов, которые ограничивают реакции местом повреждения и предотвращают возникновение массивного внутрисосудистого тромбоза. К регулирующим факторам относят: кровоток и гемодилюцию, клиренс, осуществляемый печенью и ретикулоэндотелиальной системой (РЭС), протеолитическое действие тромбина (механизм отрицательной обратной связи), ингибиторы сериновых протеаз.

При быстром кровотоке происходит разбавление активных сериновых протеаз и транспорт их в печень для утилизации. Кроме того, диспергируются и отсоединяются периферические тромбоциты от тромбоцитарных агрегатов, что ограничивает размер растущей гемостатической пробки.

Растворимые активные сериновые протеазы инактивируются и удаляются из кровообращения гепатоцитами и ретикулоэндотелиальными клетками печени (купферовскими клетками) и других органов.

Тромбин в качестве фактора, ограничивающего свёртывание, разрушает факторы XI, V, VIII, а также инициирует активацию фибринолитической системы посредством белка C, что приводит к растворению фибрина, в том числе за счёт стимуляции лейкоцитов.

Ингибиторы сериновых протеаз

Процесс свёртывания крови строго контролируется присутствующими в плазме белками (ингибиторами), которые ограничивают выраженность протеолитических реакций и обеспечивают защиту от тромбообразования (рис. 11). Главными ингибиторами факторов свёртывания крови являются антитромбин III (АТ III, гепариновый кофактор I), гепариновый кофактор II (ГК II), протеин «си» (PC) и протеин «эс» (PS), ингибитор пути тканевого фактора (ИПТФ), протеаза нексин-1 (ПН-1), C1-ингибитор, ? 1 -антитрипсин (? 1 -АТ) и ? 2 -макроглобулин (? 2 -М). Большинство этих ингибиторов, за исключением ИПТФ и ? 2 -М, относятся к серпинам (СЕРиновых Протеаз ИНгибиторы).

Антитромбин III (АТ III) является серпином и основным ингибитором тромбина, ФXa и ФIXa, он также инактивирует ФXIa и ФXIIa (рис. 11). Антитромбин III нейтрализует тромбин и другие сериновые протеазы посредством ковалентного связывания. Скорость нейтрализации сериновых протеаз антитромбином III в отсутствии гепарина (антикоагулянта) невелика и существенно увеличивается в его присутствии (в 1000 – 100000 раз). Гепарин представляет собой смесь полисульфатированных эфиров гликозаминогликанов; он синтезируется тучными клетками и гранулоцитами, его особенно много в печени, лёгких, сердце и мышцах, а также в тучных клетках и базофилах. В терапевтических целях вводят синтетический гепарин (нефракционированный гепарин, низкомолекулярные гепарины). Гепарин образует с АТ III комплекс, называемый антитромбином II (АТ II), повышая тем самым эффективность АТ III и подавляя образование и действие тромбина. Кроме того, гепарин служит активатором фибринолиза и поэтому способствует растворению сгустков крови. Значение АТ III, как основного модулятора гемостаза подтверждается наличием тенденции к тромбообразованию у лиц с врождённым или приобретённым дефицитом АТ III.

Протеинс си (PC) – витамин К-зависимый белок, синтезируемый гепатоцитами. Циркулирует в крови в неактивной форме. Активируется небольшим количеством тромбина. Эта реакция значительно ускоряется тромбомодулином (ТМ) – поверхностным белком эндотелиальных клеток, который связывается с тромбином. Тромбин в комплексе с тромбомодулином становится антикоагулянтным белком, способным активировать сериновую протеазу – PC (петля отрицательной обратной связи). Активированный PC в присутствии своего кофактора – протеина S (PS) расщепляет и инактивирует ФVa и ФVIIIa (рис. 11). PC и PS являются важными модуляторами активации свёртывания крови и их врождённый дефицит связан со склонностью к тяжёлым тромботическим нарушениям. Клиническое значение PC доказывает повышенное тромбообразование (тромбофилия) у лиц с врождённой патологией ФV (Лейденская мутация – замена гуанина 1691 аденином, что приводит к замещению аргинина глутамином в позиции 506 аминокислотной последовательности белка). Такая патология ФV устраняет сайт, по которому происходит расщепление активированным протеином C, что мешает инактивации фактора V и способствует возникновению тромбоза.

Активированный PC посредством механизма обратной связи подавляет продукцию эндотелиальными клетками ингибитора активатора плазминогена-1 (ИАП-1), оставляя без контроля тканевой активатор плазминогена (ТАП – см. разле фибринолиз). Это косвенно стимулирует фибринолитическую систему и усиливает антикоагулянтную активность активированного PC.

? 1 -антитрипсин (? 1 -АТ) нейтрализует ФXIa и активированный PC.

С1-ингибитор (С1-И) также является серпином и главным ингибитором сериновых ферментов контактной системы. Он нейтрализует 95% ФXIIa и более 50% всего калликреина, образующегося в крови. При дефиците С1-И возникает ангионевротический отёк. ФXIa инактивируется в основном ?1-антитрипсином и АТ III.

Гепариновый кофактор II (ГК II) – серпин, ингибирующий только тромбин в присутствии гепарина или дерматан-сульфата. ГК II находится преимущественно во внесосудистом пространстве, где локализуется дерматан-сульфат, и именно здесь может играть решающую роль в ингибировании тромбина. Тромбин способен стимулировать пролиферацию фибробластов и других клеток, хемотаксис моноцитов, облегчать адгезию нейтрофилов к эндотелиальным клеткам, ограничивать повреждение нервных клеток. Способность ГК II блокировать эту деятельность тромбина играет определённую роль в регулировании процессов заживления ран, воспаления или развития нервной ткани.

Протеаза нексин-1 (ПН-1) – серпин, ещё один вторичный ингибитор тромбина, предотвращающий его связывание с клеточной поверхностью.

Ингибитор пути тканевого фактора (ИПТФ) представляет собой куниновый ингибитор свёртывания (кунины гомологичны ингибитору панкреатического трипсина – апротинину). Синтезируется главным образом эндотелиальными клетками и в меньшей степени – мононуклеарами и гепатоцитами. ИПТФ связывается с ФXa, инактивируя его, а затем комплекс ИПТФ-ФXa инактивирует комплекс ТФ-ФVIIa. Нефракционированный гепарин, низкомолекулярные гепарины стимулируют выделение ИПТФ и усиливают его антикоагулянтную активность.