Отбор исходного материала.

Работу по клональному микроразмножению растений начинают с отбора исходного материала. Ис­ходный материал (верхушечные и боковые почки), взя­тый от растений, растущих в полевых условиях, очищают от кроющих чешуй и одной-двух пар листьев, промывают водопроводной водой в течение 1 — 1,5 ч, а затем почки поверхностно стерилизуют. Как стерилизатор использу­ют 0,1%-ный раствор сулемы (HgCl₂) Стерилизующий раствор всегда токсичен для растительных тканей и в той или иной сте­пени угнетает рост эксплантатов, что следует учитывать на этапе введения эксплантатов в культуру. В связи с этим необходимо точно определить время, необходимое эффективной стерилизации. Для почек смородины, например, достаточно воздействовать на материал указанным пре­паратом в течение 5—8 мин. После стерилизации почки тщательно промывают 4—5 раз по 5—7 мин в стериль­ной воде.(10)

Исходный материал можно брать в течение всего пе­риода вегетации. Опыты показали, что наиболее подхо­дящий срок для введения в культуру материала сморо­дины - активная фаза вегетации (с конца апреля до начала июля)(15)

Вычленяют изолированные апексы обычно под бино­кулярной лупой. Эксплантаты состоят из меристематического купола нескольких листовых примордиев и не­которого количества субапикальной ткани и имеют раз­мер 0,5—1 мм. Для вычленения верхушек используют тонкие препаровальные иглы, пинцеты, глазные скаль­пели и микроскальпели.(10)

После вычленения верхушки помещают в пробирки со средой и закрывают фольгой.

Отбор исходных растений в полевых условиях следует проводить путем 2-3-кратных осмотров кустов период с мая по июнь. Отбирают растения, не имеющие симптомов заражения. Отбор в более поздние сроки нецелесообразен из-за сильной мас­кировки симптомов. В лаборатории исходные растения подвергаются предварительному тестированию методом иммуноферментного анализа на наличие латентной инфекции вирусов, зара­жающих крыжовник (мозаика резухи, кольцевая пятнистость мали­ны, латентная кольцевая пятнистость земляники, черная кольчатость томата, огуречная и табачная мозаики). (3)

С середины лета и осенью концент­рация всех сокопереносимых вирусов на крыжовнике падает ниже уровня чувствительности ИФА, что чревато возможностью получения ложноотрицательных результатов. Для тестирования пригодны только листья, но не почки, кора или камбий. В состав экстрагирующего буфера необ­ходимо добавлять поливинилпироллидон и альбумин.(9)

Выделенные по результатам растения крыжовника затем подвер­гаются методу хемотерапии. Она, при оздоровлении расте­ний от вирусной инфекции, обеспечивает целый ряд преимуществ по сравнению с другими способами: позволяет отказаться от трудо-, материало- и энергозатратной суховоздушной термотерапии; дает воз­можность использовать относительно крупные инициальные экспланты (1 мм и больше); сокращает время оздоровления благодаря совмещению этапа культивирования микрорастений с терапией; обеспечивает высокий выход безвирусных регенерантов.(15)

Многолетние исследования авторов в области хемотерапии виру­сов плодовых, ягодных и декоративных культур in vitro позволили выявить наиболее эффективные виды и концентрации антивирусных препаратов, способных подавлять различающиеся по биологии илар-, поти-, непо-, рабдо-, идаео-, садва-, трихо-, капилло- и фовеавирусы и увеличивать выход безвирусных растений. К таким веществам отно­сятся аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, рибавирин, интерферон, биназа, фенольные соединения (салициловая и другие фенолкарбоновые кислоты). Высокую активность в отношении ингибирования ряда вирусов проявили также новые АВП: гипорамин, ал- пизарин, сангвиритрин, характеризующиеся безопасностью для чело­века и окружающей среды. Данный критерий при выборе препарата имеет в настоящее время первостепенное значение.(13)

Большинство препаратов отличаются низкой фитотоксичностью в оптимальных концентрациях, а в некоторых случа­ях проявляют и выраженное стимулирующее действие на процессы органогенеза у растений, повышая коэффициент размножения и ризогенную способность. Критерий отбора АВП на основании оценки их фитотоксичности наряду с высокой антивирусной активностью слу­жит важной предпосылкой изыскания антивирусных веществ.(20)

Хемотерапия вирусов в процессе оздоровления садовых растений может эффективно осуществляться как путем введения АВП в состав питательных сред, так и предварительного инкубирования заражен­ных вирусами инициальных эксплантов в водных растворах антиви­русных препаратов перед их посадкой на питательную среду.(25)

Более высокие эффекты в отношении ингибирования вирусной инфекции достигаются при 2-3-кратном применении АВП с интерва­лом не более чем в одну субкультуру и чередовании препаратов с различным механизмом антивирусного действия.(47)

Одновременное введение в состав среды нескольких видов АВП благодаря расширенному спектру антивирусного действия обеспечи­вает, как правило, высокий выход безвирусных регенерантов. Соче­тание ингибиторов различной природы позволяет использовать их в более низких концентрациях, чем при раздельном применении. Со­блюдение этих принципов снижает до минимума риск восстановле­ния инфекционных свойств вируса после адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям.(32)

Верно разработанная технологическая схема применения АВП обеспечи­вает эффективное оздоровление садовых растений от вирусов и дела­ет работу исследователей в области хемотерапии более продуктивной и целенаправленной.(10)

Метод хемотерапии вирусов in vitro в настоящее время можно рас­сматривать как высокоэффективный способ оздоровления растений от вирусной инфекции, позволяющий в сжатые сроки и с минимумом затрат получить большое число безвирусных растений.(56)

Растениям крыжовника, оказавшимся по результатам комплексного тестирования свободными от вирусов, присваивается категория безвирусных клонов; они подвергаются первичному размножению. (54)

Зараженность микрофлорой почек молодых побегов боль­ше, чем зимующих, к тому же почки, взятые с растений зи­мой, выносят более жесткий режим стерилизаций. В январе - марте внешне здоровые вызревшие побеги ставят в воду и помещают в теплую комнату на 2-3 дня (для активизации жизненных процессов). Затем тщательно промывают щеткой с мылом, секатором нарезают кусочки побега длиной 1,5-2 см, промывают водопроводной водой, затем дистиллированной и погружают на 20-30 минут в 70% этиловый спирт. После промыв­ки стерильной водой обрабатывают раствором диацида 10 мин с последующим промыванием стерильной водой. Почки, взятые с растения в период вегетации, в спирт не погружают, а после стерилизации в диациде 5-7 мин четырехкратно промывают стерильной водой.(53)