Этапы микроклонального размножения

Клональное микроразмножение растений рода Grossylaria Mill целесообразно проводить в три этапа.

I этап — введение эксплантов в культуру. Необхо­димо получить культуру, свободную от инфекции, до­биться выживания ее на питательной среде и обеспечить быстрый рост эксплантата. В качестве регулятора роста добавляют вещества цитокининовой природы. Эксперименты пока­зали, что регенерация верхушек смородины лучше и быстрее проходит на модифицированной по органиче­ским компонентам среде Мурасиге-Скуга. На такой среде в течение 3—4 недель развивается розетка листьев, дли­на побегов достигает 7—8 мм. На регенерацию верхушек смородины влияют их раз­мер (эксплантаты размером 0,5—2 мм обладают лучшей регенерационной способностью, чем размером 0,2— 0,3 мм) и время изоляции (лучше развиваются эксплан­таты, взятые в период активной фазы вегетации — с кон­ца апреля до конца июля).(34)

Отмечены также и сортовые особенности. Изолиро­ванные апексы некоторых сортов обладают разной спо­собностью к регенерации и микроразмножению. (49)

II этап —собственное клональное микроразмножение. Его можно подразделить на 3 этапа:

- Получение хорошо растущей стерильной культуры. На этом этапе необходимо правильно выбрать растение-донор, получить свободную от инфекции культуру, добиться ее выживания и быс­трого роста на питательной среде.

- Собственно размножение, осуществляемое несколькими спо­собами:

а) активизация пазушных меристем;

б) индукция образования адвентивных почек тканями листа, стеб­ля, чешуйками и донцем луковиц, корневищем и зачатками соцве­тий без первоначального образования каллусной ткани;

в) микрочеренкование побега, сохраняющего апикальное доми­нирование;

г) стимуляция образования микроклубней и микролуковичек;

индукция соматического эмбриогенеза.(10)

На этом этапе эксплантаты пересаживают из про­бирок в колбы объемом 100—250 мл по 4—5 шт. в каж­дую. В питательной среде повышают концентрацию 6-БАП, который снимает апикальное доминирование у культивируемых эксплантатов и вызывает развитие до­полнительных почек и побегов. Опыты показали, что для массового размножения эксплантатов черной и красной смородины оптимальная концентрация 6-БАП — 3 мг/л. При такой концентрации 6-БАП каждый эксплантат в зависимости от сорта за пассаж может дать от 4 до 15 дополнительных почек. Разделяя развившиеся почки и побеги и помещая их .на такие же среды, можно вновь добиться массового образования побегов и получить их в необходимом количестве.(40)

Длительное выращивание эксплантатов .на средах с повышенной концентрацией цитокининов вызывает тор­можение роста побегов. Такие побеги, пересаженные на среду для укоренения, очень часто не дают 'корней и гибнут. Поэтому перед этапом укоренения целесообраз­но ввести фазу удлинения побегов. Для этого побеги пе­ресаживают .на среду, содержащую 0,1 мг/л 6-БАП. Та­кая концентрация позволяет получать побеги нормальной пропорции, за 13—15 дней укороченные побеги достигают длины 15 мм и более. Аналогичное действие оказывает пересадка эксплантатов на среду с добавлением 6-БАП и гибберелловой кислоты (ГК) — 0,2 мг/г. 6-БАП 4* +5,0 мг/л гибберелловой кислоты. Такое сочетание препаратов стимулирует вытягивание стеблей у растений, и через две недели по­беги достигают длины 18—20 мм.(76)

- Подготовка к высадке в поле или к реализации. Это очень важный этап, во время которого в теплице укорененные расте­ния, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят закаливание растений, повышают их устойчи­вость к патогенным микроорганизмам и различным неблагопри­ятным факторам внешней среды. Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vivo. Это под­бор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные ра­стения лучше приживаются, если их заразить in vitro микоризооб- разующими грибами (Е. А. Калашникова, 1993). Упрощенный спо­соб адаптации пробирочных растений винограда был разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адап­тацию проводят прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда дорастают до верха пробирки. Через 1,5 — 2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями по­являются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву.(30)

Для предотвращения механических повреждений корневой систе­мы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, что над поверхностью почвы остаются только 2 развитых листа, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к вне­шним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этап акклиматизации растений.(25)

III этап — укоренение размноженных побегов. На этом этапе необходимо обеспечить развитие нормальной корневой системы, после чего растения либо подготавли­вают к высадке в почву, либо помещают на хранение при пониженных температурах. Последний прием имеет важ­ное значение, так как позволяет задержать развитие рас­тений и сохранить их длительное время, используя по мере необходимости.(65)

Лучше всего побеги смородины укореняются после предварительной обработки базальных частей раствором ИМК с последующей высадкой их «на среду без регуля­торов роста»

Для обработки побегов готовят раствор ИМК в кон­центрации 25 мг/л и стерилизуют его в автоклаве при давлении 0,9 атм. в течение 15 мин. В автоклаве стерили­зуют также бюксы с ватой. В стерильных условиях рас­твор ИМК разливают по бюксам. У побегов удаляют наиболее крупные листья и помещают (первые в бюксы так, чтобы их базальная часть оказалась 'погруженной в раствор. Бюксы закрывают крышкой и оставляют на 16—18 ч.

Первые корешки обычно появляются через 5—7 дней, и спустя месяц процент укоренения достигает 42—93% в зависимости от вида и сорта/ Отмечено, что сорта чер­ной смородины укореняются легче, чем красной.(48)

Вторично в раствор ИМК погружают побеги, которые в течение месяца не образовали корней. Такой способ позволяет повысить укоренение до 100%. Для укорене­ния побегов смородины наиболее подходят среда на ос­нове минеральных солей Мурасиге-Скуга, разбавленная вдвое, и среда Хеллера.