5.7. Визначення активності каталази (за о.М.Бахом та о.І.Опаріним).

Представником ферментів, що каталізує відщеплення води, є каталаза, котра розкладає пероксид водню за рівнянням:

2H₂O₂  2H₂O + O₂

Пероксид водню утворюється при відновленні молекулярного кисню в окисно-відновних процесах живих організмів, і є для клітини отруйною речовиною.

Принцип методу грунтується на врахуванні зміни кількості пероксиду водню, який визначається титруванням перманганатом калію.

Реакція проходить за рівнянням:

2KMnO₄ + 3H₂O₂ + 4H₂SO₄  2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

Про кількість пероксиду водню, що розкладається під дією ферменту, судять за різницею кількості (мл) 0,1 н. розчину KMnO₄, який витрачається на титрування в контрольному та робочому дослідах.

Хід роботи. Відбирають дві проби прозорого фільтрату або центрифугату по 20 мл кожна (дослідна та контрольна), останню кип'ятять протягом 5 хв на сітці для інактивації ферменту. До проб додають по 20 мл дистильованої води, по 3 мл 1%-го пероксиду водню, попередньо нейтралізованого 0,1 н. розчином NaOH, і залишають на 30 хв при кімнатній температурі. Потім до проб додають по 5 мл 10%-ї сірчаної кислоти, а пероксид водню, що залишився, титрують 0,1 н. розчином марганцевокислого калію. Про активність каталази судять за кількістю міліграмів пероксиду водню, яка руйнувалась протягом 30 хв ферментом, що міститься в 1 г досліджуваного матеріалу.

Активність каталази визначають за формулою:

де A – кількість 0,1 н. розчину KMnO₄, яка витрачається на титрування контролю, мл; B – кількість 0,1 н. розчину KMnO₄ яка витрачається на титрування робочого досліду, мл; 1,7 – 1 мл 0,1 н. розчину KMnO₄ еквівалентний 1,7 мг H₂O₂; n – наважка досліджуваного матеріалу в пробі, що титрується, г.

Реактиви: 1. 1,0-й розчин перекису водню; 2. 0,1 н. розчин марганцевокислого калію; 3. 10%-й розчин сірчаної кислоти; 4. Екстракт борошна чи іншого матеріалу: на аналітичних вагах зважують в мірну колбу місткістю 50 мл 2 г борошна чи іншого добре подрібненого рослинного матеріалу. В колбу приливають дистильовану воду, вміст її добре перемішують, додають 2–3 краплини толуолу, доводять водою до мітки, і суміш настоюють протягом 2 годин при кімнатній температурі. Потім рідину відфільтровують через сухий складчастий фільтр або центрифугують. У фільтраті або центрифугаті визначають каталазну активність.

5.8. Визначення активності пероксидази.

Пероксидаза каталізує окислення пероксиду водню різних органічних сполук: фенолів, амінів, деяких гетероциклічних сполук. Вона являє собою гемопротеїд, який відноситься до класу ферментів – оксидоредуктаз.

Принцип методу. Метод полягає у визначенні швидкості реакції окислення бензидину під дією пероксидази з утворенням продуктів окислення, концентрація яких заздалегідь встановлена з допомогою фотоелектроколориметра.

Хід роботи. В дві кювети фотоелектроколориметра шириною 2 см наливають по 2 мл ферментного розчину, 2 мл розчину бензидину в ацетатному буфері і перемішують. Виміри проводять при довжині хвилі 600–650 мкм. Спочатку встановлюють стрілку гальванометра на нуль, а потім обертанням правого барабану для відліку переводять стрілку гальванометра в крайнє праве положення (наприклад, 0,125 чи 0,250). Після цього в контрольну (ліву) кювету наливають 2 мл води, а в праву (дослідну) 2 мл 3%-го розчину пероксиду водню. З внесенням першої краплини пероксиду водню вмикають секундомір. При цьому під дією пероксидази протікає реакція окислення бензидину з утворенням сполук синього кольору, і стрілка гальванометра починає відхилятися до нульової поділки. Секундомір зупиняють, коли стрілка гальванометра досягне нульової поділки. Активність ферменту А визначають за швидкістю реакції та виражають в умовних одиницях на 1 г рослинного матеріалу за формулою:

де А – активність ферменту на 1 г наважки; Е – екстинкція (0,125 чи 0,250); а – об'єм екстракту; b – ступінь розбавлення у кюветі (3); n – наважка рослинного матеріалу, г; с – товщина шару рідини в кюветі (2), см; t – час, с.

Реактиви: 1. Ферментний розчин (12 г рослинного матеріалу розтирають в ступці із піском із 5 мл фосфатного буфера, рН 7,0; переносять в конічну колбу місткістю 50 мл, змивають у ступку 20 мл буфера, настоюють протягом 30 хв. і центрифугують 10–15 хв при 4000 об/хв); 2. 3,0%-й розчин пероксиду водню; 3. Розчин 0,005 М бензидину на фосфатному буфері з рН 7,0.